雨生红球藻多糖的提取分离及理化性质研究

冯以明, 李广生, 吴建东, 王培培, 赵 峡, 于广利

(1. 海洋药物(中国海洋大学)教育部重点实验室, 山东青岛 266003; 2. 山东省糖科学与糖工程重点实验室,山东青岛 266003)

雨生红球藻多糖的提取分离及理化性质研究

冯以明1,2, 李广生1,2, 吴建东1,2, 王培培1,2, 赵 峡1,2, 于广利1,2

(1. 海洋药物(中国海洋大学)教育部重点实验室, 山东青岛 266003; 2. 山东省糖科学与糖工程重点实验室,山东青岛 266003)

将雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)经乙醇/乙酸乙酯(1：2,V/V)脱脂, 通过冷水、热水和5%碳酸钠提取, 得到 3种粗多糖(HPC、HPH和HPA), 通过 Q-Sepharose FF阴离子交换柱进一步分级, 从HPC中得到HPC1、HPC2和HPC3共3种多糖组分。运用高效液相色谱法(HPLC)、红外光谱(IR)等方法对其单糖组成、相对分子质量和基本结构特征进行分析比较。结果表明, 各组分单糖组成复杂, 主要含有半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖胺(GlcN)和半乳糖胺(GalN), 其中, Gal含量最高, 大于20%。多糖HPC1、HPC2和HPC3的相对峰位分子质量分别为502.6, 373.2, 577.5和300.5 ku。

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis); 多糖; 理化性质; 单糖组成

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种在淡水中生长的单细胞绿藻, 分类学上属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。它在弱光和氮磷丰富的环境中以游动的绿色营养细胞存在, 而在不利生存的条件下, 则以厚壁的不动细胞存在,同时在细胞内积累大量的虾青素而呈红色[1]。目前,对该藻成分的研究多集中于虾青素的研究应用, 而对其多糖的相关研究未见报道。

本文以雨生红球藻粉为原料, 将其脱脂后, 采用不同提取方法获得不同种类多糖, 并对其理化性质和单糖组成进行分析, 为其多糖资源的研究利用提供基础。

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

雨生红球藻藻粉(Haematococcus pluvialis), 购于美国Cyanotech公司。葡聚糖标准品(11.8、47.3、112、212、788 ku)购于日本Shodex公司; 单糖标准品(Glc, Man, Gal, Fuc, Rha, GlcN, GalN, Xyl, Arb,GlcUA, GalUA)、标准牛血清白蛋白、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP, 99%)购于美国Sigma公司; 氯仿,甲醇等其他试剂均为国产分析纯。

强阴离子交换树脂(Q-Sepharose Fast Flow,90 μm, 美国GE Healthcare公司); 高效凝胶色谱柱(PL aquagel-OH mixed, 30 cm×7.5 mm×8 μm, 美国Perkin Elmer公司); Eclipse XDB-C18 色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm, 美国 Agilent公司); 高效液相色谱仪(LC-20AD, 日本岛津公司); 红外光谱仪(Nicolet Nexus 470型, Thermo Electron公司); 紫外可见分光光度计(UV-2102 PCS, 尤尼柯(上海)仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的提取分离[2]

雨生红球藻藻粉经乙醇/乙酸乙酯(1：2,V/V)脱脂3次[3], 收集残渣并于40 ℃烘干备用。取脱脂藻粉,加入30倍体积蒸馏水, 室温搅拌提取3 h后离心收集上清液。重复提取 2次合并上清液。将上清液旋转蒸发浓缩后, 加入4倍体积95%乙醇, 离心取沉淀,经丙酮脱水并45 ℃干燥, 得冷水提粗多糖HPC。冷水提取后的藻渣, 加入30倍体积蒸馏水, 85 ℃搅拌提取3 h后离心收集上清液。重复提取2次。合并上清液并浓缩, 加入4倍体积95%乙醇。离心收集沉淀,经脱水并干燥, 得热水提多糖 HPH。热水提取后的藻渣, 加入20倍体积5%碳酸钠, 80℃搅拌提取1.5 h后离心收集上清液。重复提取 2次。合并的上清液用4 mol/L盐酸调节pH至 7～8。浓缩上清液, 加入4倍体积 95%乙醇。离心收集沉淀, 经脱水和干燥,得碱提多糖HPA。将3种多糖样品用蒸馏水溶解后,透析(MWCO 7kD)2 d, 至透析外液的电导与蒸馏水相同。各组分溶液旋转蒸发浓缩, 干燥, 称重。提取流程见图1。

得到的多糖组分HPC经Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换色谱柱(XK 3.5/10,V=150 mL)分离纯化[4]。采用0、0.2和0.4 mol/L NaCl梯度洗脱2个柱体积(流速3 mL /min, 15mL/管), 硫酸苯酚法[5]检测,合并各组分, 经透析脱盐干燥后, 得 HPC1、HPC2和HPC3共3种多糖组分。

图1 雨生红球藻多糖的提取分离流程图Fig. 1 Extraction and separation flow chart of polysaccharides from Haematococcus pluvialis

1.2.2 理化性质分析

总糖含量以半乳糖为标准品采用硫酸苯酚法[5];硫酸基含量采用硫酸钡-明胶比浊法[6]; 粗蛋白含量采用 Folin-酚比色法[7]; 糖醛酸含量采用改良的咔唑法[8]。

1.2.3 分子质量测定及纯度测定[9]

色谱条件：色谱柱(PL aquagel-OH mixed, 8 μm,30 cm × 7.5 mm); 流动相为 0.2 mol/L NaNO3溶液(含10 mol/L NaH2PO4, pH 7.0), 流速为 0.5 mL/min,柱温为30℃; 进样量10 μL; 示差检测器。以标准多糖分子量的对数(lgMW)对保留时间(tR)作图, 得标准曲线为lgMW= 30.401-3.0775tR,R2=0.996。

1.2.4 单糖组成分析[2,10]

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱(PMP-HPLC)法测定单糖组成。样品的准备：取多糖样品各2 mg于安瓿瓶, 加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)1 mL, 封口, 105℃水解6 h。水解液旋转蒸发至干, 得完全酸水解单糖样品。色谱条件：Eclipse XDB-C18 色谱柱(4.6 mm × 150 mm, 5 μm); 流动相为含磷酸盐缓冲液和乙腈的混合溶液(83：17,V/V),流速为 1.0 mL/min, 柱温 25℃; 进样量 20 μL;245 nm检测。

1.2.5 醋酸纤维薄膜电泳

将醋酸纤维素薄膜放入50%甲醇溶液浸泡过夜,电泳前用滤纸吸去其表面的甲醇溶液, 置于电泳缓冲液中浸泡约 20 min。用滤纸吸去薄膜表面的电泳缓冲液, 分别吸取10 μL标准品和样品溶液于超级加样器孔中, 用加样器点样(0.5 μL) , 将薄膜置于电泳槽中平衡10 min。采用醋酸钡电泳缓冲液, 在如下条件进行电泳：0.05 mol/L醋酸钡(pH 5.0), 电流7 mA,电泳时间45 min电泳结束后用0.5%(W/V)阿利新蓝染色约20 min, 以2%醋酸溶液脱色。

1.2.6 红外光谱分析

样品用P2O5干燥48 h, 取1～2 mg经KBr压片,测定红外光谱, 扫描范围为400～4000 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 理化性质分析

雨生红球藻富含虾青素, 是一种非VA源类胡萝卜素, 具有亲脂性, 易溶于有机溶剂。根据文献[3],提取溶剂采用乙醇与乙酸乙酯的混合液(1：2,V/V),该藻含脂类物质30.7%。3个粗多糖组分性状均为褐色粉末, 得率均不高, 分别为 2.74%、1.36%及1.55%。HPC的总糖含量最高(69.8%)而蛋白含量最低(10.9%); HPA的总糖含量最低(33.2%)而蛋白含量最高(23.5%); 3种粗多糖的硫酸基含量和糖醛酸含量均较低(4%左右), 该特点与海洋藻中多糖不同, 这与其生长环境盐度低有关。

由于 3种粗多糖的单糖组成结果相近, 无明显区别, 故选取得率较高的粗多糖HPC过QFF强阴离子交换柱梯度洗脱分离, 见图2。从图2中可知, 样品HPC经0、0.2和0.4 mol/L NaCl梯度洗脱后, 得到3个峰(分别命名为HPC1、HPC2和HPC3)。HPC1为淡黄色粉末, HPC2和HPC3为淡褐色粉末。HPC1的总糖含量最高(84.2%), HPC3的糖醛酸含量较高(14.0%)。粗多糖和纯化后多糖的理化性质如表1。

表1 雨生红球藻中多糖的基本理化性质比较Tab. 1 The physicochemical characters comparison of polysaccharides

2.2 单糖组成分析

图2 雨生红球藻多糖Q-Sepharose FF色谱分离图Fig. 2 Segment elution graph of crude polysaccharide by Q-sepharose fast-flow column

根据文献[10], PMP柱前衍生HPLC法适合于同时分离中性、酸性和碱性单糖, 该法反应条件温和且不产生立体异构, 各单糖衍生物在245 nm处有最大吸收, 故本实验采用 PMP-HPLC法进行分析。各纯化组分的单糖组成分析谱图见图3, 单糖摩尔百分比及相对分子质量见表2。从图表中可以看出, 不同工艺提取的多糖的单糖种类多, 不仅有中性糖六碳糖Gal、Man、Glc和五碳糖Ara和Xyl, 而且有糖醛酸GlcUA、GalUA, 及其甲基糖Rha、Fuc, 还有氨基糖GlcN 和GalN。HPC1的Man和Ara含量接近20%,HPC2和HPC3的Glc含量为18%左右。HPC3的糖醛酸含量(GlcUA为 8.4%和 GalUA为 1.7%)和 Fuc含量(11.4%)相对较高, 这与其在QFF柱的洗脱顺序相符。HPC1和HPC2在Man后出现了一个未知峰(峰12), 此物质有待进一步研究。

图3 雨生红球藻中3种多糖的单糖分析谱图Fig. 3 The monosaccharides analysis of three kinds of polysaccharides

表2 3种多糖的主要单糖组成及其相对摩尔比Tab. 2 The monosaccharides composition and relative molar ratio analysis of three polysaccharides

2.3 醋酸纤维素薄膜电泳纯度分析

采用醋酸纤维素薄膜电泳对粗多糖HPC以及纯化后多糖HPC1、HPC2和HPC3进行纯度分析(图4)。HPC1为水洗组分, 不被带正电荷的阿利新蓝染色,表明其属于中性多糖, 该结果与单糖组成分析和 IR分析一致; HPC2同粗品HPC类似, 有一个主要多糖组分; 而HPC3至少有3个酸性多糖组分, 表明其分子结构高度不均一性。

2.4 红外光谱分析

从图5可以看出, 雨生红球藻多糖HPC1、HPC2和 HPC3红外光谱有相似之处,如均在 3600～3200 cm-1、2925 cm-1附近处有糖环特征吸收峰; 虽然均在1640 cm-1和1410 cm-1附近有C═O非对称和对称伸缩振动峰, 但其相对强度各不相同, 说明样品存在糖醛酸的含量不同, HPC3较高; 1240 cm-1区域的吸收峰表示S═O伸缩振动, HPC1含极少量硫酸基, HPC2, HPC3含有少量硫酸基, 该结果与表1结果相一致。

图4 不同多糖的醋酸纤维素薄膜电泳图Fig. 4 Cellulose acetate membrane electrophoresis graph of different polysaccharides

图5 3种多糖的红外光谱图比较Fig. 5 The IR spectrum comparison of three kinds of polysaccharides

3 结论

以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为原料,首次通过冷水、热水和热碱提取得到3种粗多糖, 并从冷水提取多糖HPC中进一步分离纯化出3个多糖组分。各个组分单糖组成均很复杂, 单糖种类多达十余种, 该结果和本课题组从另一种单细胞绿藻——盐藻中提取的多糖中单糖组成类似[10]。雨生红球藻中单糖种类为何如此多样, 其结构与活性关系如何等仍需要深入研究, 也为该类特殊多糖资源的开发利用提供了有用数据。

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Extraction and isolation of polysaccharides fromHaematococcus pluvialisand their physicochemical characters study

FENG Yi-ming1,2, LI Guang-sheng1,2, WU Jian-dong1,2, WANG Pei-pei1,2, ZHAO Xia1,2, YU Guang-li1,2
(1. Key Laboratory of Marine Drugs (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China;2. Shandong Provincial Key Laboratory of Glycoscience and Glycoengineering, Qingdao 266003, China)

Jan., 27, 2011

Haematococcus pluvialis; polysaccharide; Extraction; isolation; monosaccharide composition

Three kinds of crude polysaccharides HPC, HPH and HPA were obtained from aqueous extracts of the green algaHaematococcus pluvialiswith cold water, hot water and 5% Na2CO3water solution. The crude extracts were fractionated by ion-exchange chromatography of Q-Sepharose Fast Flow column. The purified extracts were named HPC1, HPC2 and HPC3. The monosaccharide composition, relative molecular mass (Mw) and structural feature of the polysaccharides were analyzed and compared by high-performance liquid chromatography (HPLC)and Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR), respectively. The results showed that the monosaccharide composition was complicated and the main components included Galactose, Mannose, Arabinose, Glucose, Glucuronic acid, Galacturonic acid, Xylose, Rhamnose, Fucose, Glucosamine and Galactosamine. In particular, the content of Galactose was the highest and it’s higher than 20%. The relative molecular masses of polysaccharides HPC1, HPC2 and HPC3 were 502.6, 373.2, 577.5 and 300.5 ku, respectively.

Q949.21+2; R282.77 文献标识码：A 文章编号：1000-3096(2012)01-0017-06

2011-01-27;

2011-04-29

国家自然科学基金项目(31070724; 30870506); 国家海洋局公益专项(201005024)项目; 长江学者和创新团队发展计划(IRT0944)项目资助

冯以明(1986-), 女, 山西长治人, 硕士研究生, 研究方向：海洋糖药物; 于广利, 通信作者, 教授, 电话：0532-82031609, E-mail：glyu@ouc.edu.cn

康亦兼)