筋脉通含药血清降低高糖培养大鼠雪旺细胞活性氧水平及PARP-1蛋白表达

石 玥，梁晓春*，张 宏，王普艳，赵 丽

(中国医学科学院北京协和医学院1.北京协和医院中医科转化医学中心，北京100730;2.基础医学研究所细胞中心，北京100005)

筋脉通含药血清降低高糖培养大鼠雪旺细胞活性氧水平及PARP-1蛋白表达

石 玥1，梁晓春1*，张 宏2，王普艳1，赵 丽1

(中国医学科学院北京协和医学院1.北京协和医院中医科转化医学中心，北京100730;2.基础医学研究所细胞中心，北京100005)

目的 研究筋脉通含药血清对体外高糖培养雪旺细胞活性氧(ROS)水平及多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)蛋白表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为3组，分别灌胃筋脉通(JMT)、维生素C(VC)或蒸馏水制备含药血清和对照血清。取新出生大鼠的双侧坐骨神经用于制备雪旺细胞，分为高糖组、JMT组(加入筋脉通含药血清)、VC组(加入维生素C含药血清)及正常对照组。培养48 h后，采用激光扫描共聚焦显微技术检测细胞内二氯荧光黄(DCF)的荧光强度而测得细胞内ROS水平;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞PARP-1(89 ku)的蛋白表达。结果 1)高糖组雪旺细胞ROS-DCF荧光值(86.59±8.14)显著高于正常值(P＜0.01);筋脉通含药血清组(44.58±8.67)与维生素C含药血清组(46.12±8.80)均显著低于高糖组(P＜0.01)。2)与正常组比较，高糖组雪旺细胞内PARP-1(89 ku)含量(0.712±0.012)明显增加(P＜0.01);与高糖组比较，筋脉通含药血清组含量(0.307±0.025)明显降低(P＜0.01)，且明显优于维生素C组(0.594±0.017)(P＜0.01)。结论 筋脉通含药血清能显著减少ROS生成，降低PARP-1的活性和酶解，减轻细胞DNA氧化损伤。

雪旺细胞;高糖;氧化应激损伤;PARP-1;筋脉通

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常见的慢性并发症之一，文献报道患病率达40% ～90%，是导致糖尿病患者足溃疡或非创伤性截肢最常见的原因［1］。雪旺细胞(Schwann cell，SC)作为周围神经系统特有的胶质细胞，具有形成髓鞘和促进轴索生长及再生的作用，SC因氧化应激而发生细胞凋亡是导致上述DPN病理改变的重要原因之一。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase-1，PARP-1)是一类催化聚ADP核糖化的核酶，广泛存在于除酵母外所有真核细胞中，具有修复DNA损伤、调控基因转录、促细胞分裂和维持染色质及基因组稳定等生理功能［2］。有研究发现，PARP在抗氧化应激，保护雪旺细胞，改善糖尿病周围神经病变过程中发挥着重要的作用［3］。本研究既往研究已证实中药筋脉通可以增进高糖培养SC的增殖，促进其分泌神经生长因子［4］，具有降低 NF-κB 的蛋白及其 mRNA 的表达［5］等作用。本实验进一步探讨筋脉通对雪旺细胞ROS水平及PARP-1蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:SPF级出生3～5 d的SD雄性乳鼠以及出生6～8周雄性SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:京2007-0001)。前者用于雪旺细胞原代培养，后者用于含药血清的制备。

1.1.2 实验药物:筋脉通胶囊(由菟丝子、女贞子、水蛭、桂枝、元胡及细辛等组成)，中国医学科学院北京协和医院院内制剂，每粒含生药0.35 g，批准文号(97)京卫药制加字［48］第F-292号，生产批号061019。维生素C(Vitamin C，VC)(北京双鹤药业股份有限公司)，0.1 g/片，批准文号国药准字H11021503，生产批号080213。

1.1.3 主要试剂:胎牛血清蛋白、细胞培养基(DMEM)和0.05%胰蛋白酶(Hyclone公司)，HEPES(Amresco公司)，L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和活性氧检测试剂盒(Sigma公司)，Cleaved-PARP-1(89 ku)多克隆抗体(CST)、FITC标记山羊抗大鼠IgG、一抗稀释液和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)，DNaseI(Takara公司)，兔抗鼠S-100多克隆抗体(武汉博士德公司)，猪抗兔荧光二抗/FITC(Dako公司)Triton-X100(Nacayouitesuwa株式会社)，ENMED(Scientifics公司)，EDTA(北京化学试剂公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清及正常大鼠血清的制备:随机将大鼠分为筋脉通含药血清组、维生素C含药血清组以及正常组，适应性喂养24 h后开始每天2次灌胃。筋脉通组按成人剂量的15倍给药，即1.312 5 g/kg;维生素 C组按成人剂量的 15倍给药，即0.075 g/kg;正常组予同等体积蒸馏水，连续3 d。于末次灌胃后2 h内进行血液采集。腹腔注射12%乌拉坦(1 mL/100 g BW)麻醉，无菌条件下颈总动脉取血，室温静置2 h后，4 000 r/min离心10 min，分离血清，56℃水浴灭活30 min，分装，置-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 SC的原代培养、纯化、传代以及鉴定:无菌条件下，取新生5～8 d乳鼠，切取双侧坐骨神经，D-Hank's漂洗后将组织剪碎至1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm左右小块，均匀接种于含胎牛血清20%的DMEM培养基中，5%37℃ CO2培养箱中培养。48 h后首次换液，2～3 d换液1次。当细胞生长到覆盖瓶底壁的80%以上时，D-Hank's液冲洗，加入0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化约3～5 min，离心弃上清，完全培养基重悬，接种于T25培养瓶，差速贴壁30 min后收集细胞悬液，以1×105个细胞/mL浓度接种于T25培养瓶，37℃ CO2培养箱中继续培养。当细胞汇合程度达80% ～90%时即可进行传代，吸去原培养液，D-Hank's液冲洗，消化，计数后稀释至浓度为(2～4)×105cells/mL进行传代。取第3代生长良好的细胞，进行S-100蛋白免疫组织化学鉴定，胞质显棕黄色者为阳性细胞。

1.2.3 分组及含药血清干预:根据本实验既往研究结果，设定50 mmol/L葡萄糖为高糖浓度，1∶2稀释筋脉通含药血清、1∶1维生素C含药血清作为理想干预条件，药物作用后的第48小时为观察点。综合分析不同浓度筋脉通含药血清干预后SC的生长曲线与细胞形态，分为1)正常对照组(Con):DMEM培养基+20%正常大鼠血清;2)高糖对照组(Glu):DMEM(50 mmol/L Glu)培养基+20%正常大鼠血清;3)筋脉通(JMT)组:DMEM(50 mmol/L Glu)培养基+10%筋脉通含药血清+10%正常大鼠血清;4)维生素C(VC)组:DMEM(50 mmol/L Glu)培养基+20%VC含药血清。

1.2.4 免疫荧光技术检测筋脉通含药血清对高糖培养SC活性氧水平的影响:取第3代SC进行消化，按上述分组所配制的条件培养液稀释成细胞悬液，按1×105细胞/孔的浓度接种于置有盖玻片的6孔板内，置5%CO237℃培养箱培养48 h。PBS漂洗后加入荧光探针 DCFH-DA(1∶1 000)，10～20 μL/片，37℃湿盒内孵育30 min。阴性对照组以0.01 mol/L PBS代替一抗。PBS液振洗后GENMED封片处理液封片，于激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)扫描。探测FITC荧光强度，激发光为488 nm，发射光为525 nm。CLSM下观察并照相，所摄图像以 Leica Confocal图像分析软件检测绿色荧光强度，每组计数15～20个细胞。

1.2.5 Western blot检测雪旺细胞PARP-1(89 ku)蛋白表达:1)细胞总蛋白的提取，接种SC于6孔板中，当细胞汇合至70% ～80%时，PBS冲洗，每孔加入100 μL细胞裂解液，细胞刮刀刮下贴壁细胞转移至微量离心管中涡旋振荡器振荡，使细胞充分裂解，收集悬液，4℃ 12 000 r/min离心10 min，吸取上清，-80℃保存。2)BCA法测定总蛋白浓度，PBS溶液稀释待测蛋白样品(5倍稀释)，取BCA试剂盒A液和B液适量以50∶1的比例混匀形成浅绿色工作液。将50 μL不同浓度梯度的BSA标准品及稀释好的待测蛋白样品分别与400 μL工作液混合，37℃水浴反应30 min。将反应后的蛋白溶液，分别取200 μL(每个标准品或样品设置二个重复孔)加入到96孔板中，振荡30 s。酶标仪单波长570 nm测A值，绘标准曲线。待测样品浓度通过计算标准曲线公式获得。3)SDS-PAGE、蛋白质印迹、ECL显色反应，计算蛋白上样体积，将蛋白与5×上样缓冲液按体积比1∶4混合，100 ℃沸水煮5 min，12 000 r/min离心10 min，使蛋白内絮状物充分沉淀。按顺序吸取蛋白样品(50 μg总蛋白)至加样孔内，进行电泳。开始电压为60 V(恒压)，待染料进入分离胶后，将电压增加到100 V，继续电泳直到染料抵达分离胶底部。

SDS-PAGE结束后，冰浴中进行电转(恒压60 V)3 h。电转结束后，丽春红染液染色，TBS-T漂洗，可见蛋白条带。标记边侧的蛋白质分子量标准，根据目的蛋白的分子质量对转印膜进行裁剪。将标记好的转印膜经TBS-T漂洗，加入适量封闭液中，室温轻摇30 min。将转印膜放入杂交袋内，按0.1 mL/cm2加入抗体稀释液(3%BSA/PBS)、PARP-1(89 ku)抗体和β-actin抗体(1∶1 000稀释)。于4℃摇床上轻摇过夜。TBS-T漂洗，加入抗体稀释液后加入兔抗鼠HRP-IgG，室温轻摇1 h，TBS-T漂洗。

各取等体积ECL试剂A液、B液混合，将ECL混合液加到转印膜上，反应1 min，将转印膜连同黑色背景进行曝光拍照，保存电子格式Tiff结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析及处理。分析前采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的数据采用均数±标准差(±s)描述，多组独立样本比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);非正态分布数据采用非参数检验方法(k个独立样本的检验)。

2 结果

2.1 筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞内ROS水平的影响

阳性对照组活性氧试剂盒绿色荧光表达最强;高糖组表达比阳性对照组稍弱;VC组和JMT组亦可见表达，但都较高糖组弱;而正常对照组(Con)与阴性对照组仅见模糊细胞影，染色不明显。高糖组SC中ROS-DCF的荧光强度显著高于正常对照组(P＜0.01)。JMT组及VC组ROS-DCF的荧光强度值均较Con组显著增高(P＜0.01)，较高糖组显著降低(P＜0.01)(表1)。

表1 筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞ROS表达的影响Table 1 Effect of Chinese herbal medicine Jinmaitongmedicated serum on the expression of ROS in Schwann cell cultured in high-glucose medium(±s)

表1 筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞ROS表达的影响Table 1 Effect of Chinese herbal medicine Jinmaitongmedicated serum on the expression of ROS in Schwann cell cultured in high-glucose medium(±s)

*P ＜0.01，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.01，##P＜0.01 compared with high glucose group.

group ROS-DCF fluorescent intensity control 4.59±2.95 50 mmol/L Glu 86.59±8.14＊＊JMT 44.58±8.67*#VC 46.12±8.80＊＊##

图1 各组高糖培养SC内PARP-1蛋白表达的结果Fig 1 Expression of PARP-1(89 ku)among each group in Schwann cell cultured in high-glucose medium

2.2 筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞PARP-1表达的影响

免疫印迹法(Western blot)检测高糖培养SC内PARP-1结果显示(图1，表2):Con组大鼠坐骨神经在89ku处出现轻淡条带，浓度与本底接近，其余各组均在89 ku出现明显条带。密度扫描分析显示:与Con组比较，高糖组SC内PARP-1的IA值明显增加(P＜0.01)，JMT组及VC组SC内PARP-1 IA值均较Con组显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。与高糖组比较，JMT组 SC内PARP-1 IA值显著降低(P＜0.01);VC组SC内PARP-1 IA值亦显著降低(P＜0.05)。治疗组间比较，JMT组SC内PARP-1 IA值明显低于VC组(P＜0.01)。

表2 各组高糖培养SC内PARP-1蛋白表达IA值比较Table 2 IA of the expression of PARP-1 among each group in Schwann cell cultured in highglucose medium(±s)

表2 各组高糖培养SC内PARP-1蛋白表达IA值比较Table 2 IA of the expression of PARP-1 among each group in Schwann cell cultured in highglucose medium(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 compared with high glucose group;▲P ＜0.01 compared with VC group.

group IA of PARP-1 control 0.071±0.013 50mmol/L Glu 0.712±0.012＊＊JMT 0.307 ±0.025*##▲VC 0.594±0.017＊＊#

3 讨论

SC作为周围神经的髓鞘形成细胞，其形态学和生物学改变可直接影响神经再生的微环境，可导致轴索不能生长或再生速度下降［6-7］。当SC暴露在高糖环境中时，葡萄糖顺浓度梯度转运到细胞内部，SC内的高糖状态可以通过线粒体呼吸链和酶氧化以及AGE的堆积等途径增加ROS的来源［8］。氧化应激损伤时，被激活活化的PARP通过将NAD+中的ADP核糖转移到核蛋白上而启动一个能量消耗循环，导致细胞内NAD+和ATP池的耗竭，减慢糖酵解和线粒体呼吸速度，导致细胞功能紊乱发生细胞凋亡。PARP-1是PARP家族中含量最多，功能最重要的一个成员［9］。PARP-1(89 ku)片段具有该酶的自我修饰域和催化域，不具有结合损伤DNA的活性，只保持了PARP酶的基本活性。因此在组织及细胞中发现PARP-1裂解89 ku片段的出现，代表细胞凋亡程序启动［10］。

中医认为DPN的主要病机是由于消渴日久，肾阴受损，阴虚内热，煎熬津液，血黏成瘀，阻滞筋脉;久致阴损及阳，寒凝血滞，气血不能通达四肢，肌肉筋脉失于濡养所致。中药筋脉通以“补肾活血、温筋通络”为组方依据［11］，遣菟丝子、女贞子、元胡、水蛭、桂枝、细辛等药味组方而成。菟丝子女贞子共为君药，菟丝子阴阳双补，女贞子善滋养肝肾之阴并清虚热，两者配伍寓阳中求阴之意，俱补肾之阴阳。

目前临床常用的抗氧化药物有维生素C、维生素E和α-硫辛酸。维生素E和α-硫辛酸是脂溶性或醇溶性抗氧化剂，给药方式与水溶性试验药物存在差异，易导致实验条件偏倚，而水溶性抗氧化剂维生素C与实验药物在使用方法上则更趋于一致。维生素C可与O2-、HOO-及 OH-迅速反应，生成半脱氢抗坏血酸［12］，清除单线态氧，还原硫自由基，抑制动脉内皮细胞产生脂质过氧化，促进前列环素2合成，发挥延缓细胞凋亡和抗氧化作用［13］，故本研究选择水溶性抗氧化剂维生素C作为本实验的阳性对照药物。本次研究的结果显示，筋脉通和维生素C含药血清组均能削弱SC内ROS荧光探针的表达强度，在细胞水平上二者抗氧化能力接近。进一步对DNA氧化损伤致细胞凋亡途径中的关键环节进行检测，发现筋脉通能够明显降低PARP-1的过度表达，抑制细胞凋亡的发生，作用优于维生素C。现代药理研究认为菟丝子中含有多种抗氧化作用的活性成分，包括槲皮素、紫云英甙、金丝桃甙和槲皮素-3-O-β-半乳糖-7-O-β-葡萄糖甙等。而女贞子中发挥抗氧化作用的主要成分为槲皮素和红景天苷。槲皮素在体内外对各种自由基的清除作用已被许多实验证明。通过磷钼法测定其总抗氧化能力(TAC)，发现其在pH 7-9.5之间与水溶性维生素E相当，约3倍于姜黄素［14］。槲皮素的抗氧化应激作用明显强于芦丁、白藜芦醇、柚皮素等其他黄酮类化合物，成为抗氧化应激天然药物的优先选择［15］。另一方面，虽然筋脉通含药血清与VC抗氧化应激能力相当，但是在抑制PARP-1方面却表现了明显优势，可能与中药复方制剂多靶点多途径作用相关，提示筋脉通复方制剂可能通过其他途径抑制神经细胞凋亡，有待我们进一步的研究阐释。

综上所述，筋脉通可以有效减少ROS的生成，减轻DNA氧化损伤，并抑制DNA损伤感受器PARP的活性和酶解，从而阻止细胞凋亡程序的执行。这可能是中药筋脉通防止神经组织结构破坏，起到对周围神经保护作用的途径之一。

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Effects of Chinese herbal medicine Jinmaitong-containing serum on the ROS level and expression of PARP-1 of rat Schwann cells cultured in high-glucose medium

SHI Yue1，LIANG Xiao-chun1*，ZHANG Hong2，WANG Pu-yan1，ZHAO Li1

(1.Dept.of Traditional Chinese Medicine，Translational Medicine Center，PUMC Hospital，CAMS ＆ PUMC，Beijing 100730;2.Institute of Basic Medical Sciences，CAMS ＆ PUMC，Beijing 100005，China)

ObjectiveTo investigate the effects of medicated serum prepared by administration of Jinmaitong(JMT)，a compound Chinese herbal medicine，on oxidative damage and poly ADP-ribose polymerase-1(PARP-1)of Schwann cells cultured in high-glucose medium.MethodsSD rats were divided into normal control group(distilled water)，JMT group and vitamin C group to prepare medicated serum.Bilateral sciatic nerves of new born SD rats were used to separate Schwann cells.Schwann cells cultured in high-glucose medium were divided into high glucose group(50 mmol/L glucose medium，JMT group(JMT-medica-ted serum)and vitamin C(VC)group(VC-medicated serum).Schwann cells cultured in DMEM were used as the normal control.After 48 h culturing，the level of ROS was measured by confocal laser scanning microscope with 2'，7'-dichlorofluorescein(DCF)as a molecular probe and the expression of PARP-1 protein was detected by Western blot.Results1)Compared with high glucose group，the fluorescence intensities of ROS-DEC in Schwann cells cultured in JMT and VC groups were weaker significantly(P＜0.01).There were no significant differences between these two treated groups.2)Compared with high glucose group，the expression of PARP-1(89 ku)in Schwann cells cultrued in JMT group decreased significantly(P＜0.01).The expression of JMT group was also much lower than that of VC group(P＜0.01).ConclusionsThe medicated serum of JMT down-regulates the expression of ROS and PARP-1 of Schwann cells cultured in high glucose medium and reduces the oxidative DNA damage.

Schwann cell;high glucose;oxidation damage;PARP-1;Jinmaitong capsule

R 2

A

1001-6325(2012)09-1059-05

2011-10-31

2011-12-26

北京市自然科学基金(7082077)

*通信作者(corresponding author):xcliang@vip.sina.com