PI3K/Akt信号通路上调急性肺损伤大鼠肺泡上皮钠通道表达

邓 旺，王导新，邓 嘉，朱 涛

(重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆400010)

PI3K/Akt信号通路上调急性肺损伤大鼠肺泡上皮钠通道表达

邓 旺，王导新*，邓 嘉，朱 涛

(重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆400010)

目的 探讨PI3K/Akt信号通路对急性肺损伤(ALI)大鼠肺泡上皮钠通道(ENaC)α、β和γ亚基表达的影响。方法 成年SD大鼠随机分为对照组、ALI组(脂多糖)、胰岛素组及渥曼青霉素组，每组5只。观察肺组织病理改变，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，测量总肺水含量，RT-PCR和Western blot测定ENaC mRNA和蛋白、p-Akt表达。结果 胰岛素组BALF蛋白含量、髓过氧化物酶(MPO)活性、总肺水含量较ALI组显著减少(P＜0.05)，渥曼青霉素组BALF蛋白含量、MPO活性及总肺水含量较胰岛素组显著增加(P＜0.05)。ALI组α-、β-和γ-ENaC蛋白表达显著低于对照组(0.33±0.06 vs 1.27±0.07，0.18±0.04 vs 0.72±0.04，0.37±0.04 vs 0.69±0.05)(P＜ 0.05)。胰岛素组蛋白表达α-ENaC(2.19±0.04)、β-ENaC(1.18±0.07)和γ-ENaC(1.18±0.08)显著高于ALI组(P＜ 0.05)。渥曼青霉素组蛋白表达α-ENaC(0.86±0.09)、β-ENaC(0.58±0.05)和γ-ENaC(0.59±0.02)显著低于胰岛素组(P＜0.05)。胰岛素组ENaC mRNA和p-Akt较ALI组显著升高(P＜0.05)。渥曼青霉素组ENaC mRNA和p-Akt较胰岛素组显著降低(P＜0.05)。结论 激活PI3K/Akt通路上调3种ENaC亚基表达，从而清除肺水肿液。

急性肺损伤;肺泡上皮钠离子通道;PI3K/Akt信号通路

急性肺损伤(actue lung injury，ALI)时肺泡上皮损伤导致肺泡腔内富含蛋白的水肿液聚集，有效地清除过多的水肿液对维持正常气体交换及预后具有重要意义［1］。同时，肺泡上皮钠通道(epithelial sodium channel，ENaC)是清除肺泡水肿液的重要环节［2］。磷酯酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)参与细胞分化与代谢，其下游的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通过胰岛素激活PI3K而活化，是胰岛素作用的重要通路［3］。PI3K/Akt信号通路是一种保护机体应对各种应激的重要生存通路，对肺损伤具有保护作用［4］。胰岛素激活PI3K/Akt信号通路能否参与调控ENaC，并影响ALI肺泡水肿液的清除尚不清楚。本研究建立ALI大鼠模型，观察PI3K/Akt信号通路对ENaC各亚基表达的影响，探讨PI3K/Akt信号通路在ALI中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

清洁级雄性SD大鼠20只，体质量(230±20)g［重庆医科大学动物实验中心提供，许可证号:SCXK(渝)2007-0001］，重组人胰岛素(EliLilly公司)，脂多糖(LPS，E．coli，O111:B4)和渥曼青霉素(Sigma公司)，髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)检测试剂盒(南京建成工程生物研究所)，总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，α-、β-、γ-ENaC 及 β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(Abcam公司)，Akt抗体及磷酸化Akt(p-Akt)(Ser473)抗体(Cell Signaling公司)。

1.2 动物模型、分组及血糖监测

给大鼠腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，用微量泵从左侧颈静泵入药物。大鼠随机分为对照组，仅泵入等量的0.9%氯化钠注射液;ALI组，腹腔注射脂多糖(LPS，5.0 mg/kg)建立ALI模型;胰岛素组(LPS+胰岛素)，持续泵入胰岛素0.1 U/(kg·h);渥曼青霉素组(LPS+胰岛素+渥曼青霉素)，在持续泵入胰岛素0.1 U/(kg·h)的同时，分别于LPS注射前90 min，注射后90及360 min 3次静脉给渥曼青霉素(0.06 mg/kg)。每组大鼠5只。各组药物作用8 h后处死大鼠，收集标本及监测不同时间点大鼠血糖水平。

1.3 病理检查

取右下肺叶组织，常规HE染色，观察肺组织病理学改变。

1.4 总肺水含量(total lung water content，TLW)测定

取右肺上叶，称湿重。然后置于80℃烤箱中烘烤48 h，再称重。根据公式计算:TLW=(湿重－干重)/干重［5］。

1.5 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)收集

结扎右肺门，常规收集BALF，储存－80℃以备检测蛋白浓度和MPO活性。BALF中的蛋白浓度测定采用BCA法(bicinchoninic acid)。

1.6 RT-PCR

用总RNA提取试剂盒提取肺组织总RNA。PCR引物序列:α-ENaC(509 bp)上游引物:5'-TACC CTTCCAAGTATACACAGC-3'，下游引物:5'-CAGAA GGAGACTCCGAATTAGT-3';β-ENaC(406 bp)上游引物:5'-GCTAAAGAGCTAGCAGTAATGG-3'，下游引物:5'-CTGGTGTTTGTTATGCCTAGAG-3';γ-ENaC(363 bp)上游引物:5'-GGATCCTGAGAGAGAATC ATGC-3'，下游引物:5'-GTGTCCAGCTATGCCCTTT AAC-3';β-actin(871 bp)上游引物:5'-GTACAACCT TCTTGCAGCTCCT-3'，下游引物:5'-ACAGGATTCCA TACCCAGGAAG-3'。PCR反应条件:预变性94℃1 min，变性94 ℃ 30 s，退火53 ℃(α-ENaC)、53 ℃(β-ENaC)、55 ℃ (γ-ENaC)和55 ℃ (β-actin)30 s，72℃ 1 min，30个循环。PCR产物8 μL与上样缓冲液混匀，1.2%琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像，Quantity One软件分析条带密度，以目的条带与β-actin比值作为结果。

1.7 Western blot检测ENaC蛋白的表达

提取肺组织蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，－80℃保存。蛋白样品经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜上。用脱脂奶粉封闭1 h，分别加入抗体 α-ENaC(1∶300)、β-ENaC(1∶1 000)、γ-ENaC(1∶1 000)、p-AK(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)4 ℃孵育过夜。洗膜 3遍，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1.5 h，ECL显色。凝胶成像，Quantity One软件分析条带吸光度值，以目的条带与β-actin比值作为结果。

1.8 统计学分析

所有数据均以均数±标准差(±s)表示，统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)或者Student's-t检验，运用SPSS13.0统计软件分析处理。

2 结果

2.1 不同时间点的血糖水平

胰岛素0.1 U/(kg·h)对大鼠血糖无显著影响，血糖维持在4.7～5.2 mmol/L之间。在0、1、4和8 h，胰岛素0.1 U/(kg·h)和渥曼青霉素(0.06 mg/kg)干预，对ALI大鼠血糖也无显著影响。

2.2 肺组织病理变化

对照组(图1A)肺组织未见肺泡及间质明显水肿和炎性细胞浸润，未见透明膜形成。ALI组可见肺泡及间质水肿，出血明显，炎性细胞浸润，肺泡腔内可见透明膜形成(图1B)。胰岛素治疗后，显著减轻肺泡及间质水肿，出血减轻，少量炎性细胞浸润(图1C)。渥曼青霉素干预后，可见肺泡及间质水肿，出血明显，炎性细胞浸润增加，肺泡腔内透明膜形成(图1D)。

2.3 TLW及BALF中蛋白含量和MPO活性变化

与对照组比较，ALI组 TLW明显增加(P＜0.05)，蛋白含量和MPO活性显著增加(P＜0.05)。与ALI组比较，胰岛素组 TLW明显减少(P＜0.05)，蛋白含量和MPO活性显著降低(P＜0.05)。与胰岛素组比较，渥曼青霉素干预后TLW显著增加(P＜0.05)，蛋白含量和MPO活性显著增加(P＜0.05)(表1)。

表1 TLW和BALF中蛋白含量及MPO活性Table 1 TLW and total protein and MPO activity in BALF(±s，n=5)

表1 TLW和BALF中蛋白含量及MPO活性Table 1 TLW and total protein and MPO activity in BALF(±s，n=5)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with ALI group;ΔP ＜0.05 compared with Insulin group．

group TLW(g/g) total protein(g/L)MPO activity(U/L)control 1.65±0.42 1.32±0.24 1.16±0.52 ALI 7.39±1.01* 8.54±0.66* 8.86±1.69*insulin 3.02±0.78# 4.83±0.55# 4.21±0.75#wortmannin 5.71±0.99Δ 6.89±0.29Δ 6.61±0.92Δ

2.4 肺组织ENaC mRNA的表达

ALI组 α-、β-、γ-ENaCmRNA 表达比对照组显著降低(P＜0.05)。与ALI组比较，胰岛素组α-、β-、γ-ENaCmRNA表达显著升高(P＜0.05)。渥曼青霉素干预后 α-、β-、γ-ENaCmRNA 表达较胰岛素组显著降低(P＜0.05)(图2，表2)。

图1 大鼠肺组织形态学改变Fig 1 Histology changes of rat lung(×100)

图2 ENaC mRNA的表达Fig 2 Expression of ENaC mRNA

表2 ENaC mRNA的表达Table 2 Expression of ENaC mRNA(±s，n=5)

表2 ENaC mRNA的表达Table 2 Expression of ENaC mRNA(±s，n=5)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with ALI group;ΔP ＜0.05 compared with insulin group．

-ENaC control 0.694±0.054 0.354±0.043 0.226±0.031 group α-ENaC β-ENaC γ ALI 0.152±0.037* 0.148±0.036* 0.122±0.035*insulin 1.164±0.099# 0.602±0.081# 0.440±0.064#wortmannin 0.438±0.075Δ 0.264±0.050Δ 0.168±0.024Δ

2.5 肺组织ENaC蛋白的表达

ALI组 α-、β-、γ-ENaC 蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05)。与 ALI组比较，胰岛素组 α-、β-、γ-ENaC蛋白表达显著升高(P＜0.05)。渥曼青霉素干预后α-、β-、γ-ENaC蛋白表达较胰岛素组显著降低(P＜0.05)(图3，表3)。

2.6 肺组织p-Akt的活化

ALI组中p-Akt表达较对照组明显减少(P＜0.05)。与ALI组比较，胰岛素组p-Akt表达明显提高(P＜0.05)。渥曼青霉素干预后p-Akt表达较胰岛素组明显减少(P＜0.05)(图4，表3)。

3 讨论

肺泡腔内过多的富含蛋白的水肿液聚集导致氧合功能障碍是ALI发生的重要病理生理特征，因此，有效地清除过多的水肿液，维持肺泡腔干燥，能降低ALI的死亡率［6］。最近研究表明在维持正常血糖情况下，外源性胰岛素治疗能减轻 ALI的肺损伤［7］。本研究持续泵入的胰岛素剂量维持了大鼠血糖在正常范围内，没有引起ALI大鼠血糖的显著变化。

表3 肺组织ENaC及p-Akt蛋白的表达Table 3 Expression of ENaC protein and p-Akt in lung tissue(±s，n=5)

表3 肺组织ENaC及p-Akt蛋白的表达Table 3 Expression of ENaC protein and p-Akt in lung tissue(±s，n=5)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with ALI group;ΔP ＜0.05 compared with insulin group．

-ENaC p-Akt control 1.27±0.07 0.72±0.04 0.69±0.05 0.37±group α-ENaC β-ENaC γ 0.05 ALI 0.33±0.06* 0.18±0.04* 0.37±0.04* 0.18±0.03*insulin 2.19±0.04# 1.18±0.07# 1.18±0.08# 1.17±0.07#wortmannin 0.86±0.09Δ 0.58±0.05Δ 0.59±0.02Δ 0.24±0.04Δ

腹腔注入LPS后能激活腹腔巨噬细胞及其他免疫细胞，产生炎性反应介质，吸收入血后使中性粒细胞等炎性细胞聚集在肺毛细血管处，释放活性氧，引起肺泡毛细血管屏障渗漏，导致间质及肺泡水肿［8］。MPO 作为反应中性粒细胞活性的指标［9］。结果显示胰岛素治疗能有效减轻ALI的TLW、BALF的蛋白渗出及 MPO活性和肺损伤程度，肺组织p-Akt表达也显著增加。用渥曼青霉素(抑制PI3K/Akt通路［10］)干预后，明显抑制了胰岛素引起的保护效应，肺组织中p-Akt表达也减少。提示，激活PI3K/Akt通路减少了肺水肿液及蛋白渗出，减轻了肺损伤，保护了肺组织。

ENaC由 α、β 和 γ 3个亚基组成。α-、β-和γ-ENaC是肺水肿液清除必不可少的［11］。研究显示胰岛素调控ENaC的表达需要PI3K的参与，但其具体信号通路尚未阐明［12］。本实验显示胰岛素治疗能显著上调 ALI引起的 α-、β-和 γ-ENaC mRNA 及蛋白表达的下降，p-Akt表达增加。渥曼青霉素干预后，α-、β-和γ-ENaC mRNA 及蛋白的表达显著下降，p-Akt表达减少。说明激活PI3K/Akt信号通路能上调 α-、β-和 γ-ENaC 的表达，阻断 PI3K/Akt信号通路则下调α-、β-和γ-ENaC的表达。本结果也显示α-、β-和γ-ENaC表达上调使肺水肿液含量及BALF蛋白渗出减少，进一步证明了激活PI3K/Akt信号通路上调ENaC的表达，从而对过多的蛋白水肿液清除的作用。

综上所述，激活 PI3K/Akt信号通路能上调ENaC的表达，清除ALI时肺内多余的水肿液，从而减轻肺组织损伤。

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PI3K/Akt signaling pathway up-regulates the expression of alveolar epithelial sodium channel in acute lung injury rats

DENG Wang，WANG Dao-xin*，DENG Jia，ZHU Tao

(Dept．of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China)

ObjectiveTo investigate the role of PI3K/Akt signaling pathway on expression of alveolar epithelial sodium channel(ENaC)α，β and γ subunits in LPS-induced acute lung injury(ALI)．MethodsAdult SD rats were randomly divided into control group，ALI group，insulin group and wortmannin group with 5 rats in each．The pathological changes in lung，total lung water content(TLW)，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were analyzed and the mRNA and protein level of ENaC and level of p-Akt were determined by RT-PCRand Western blot．ResultsProtein level and MPO activity in BALF and TLW in insulin group were significantly lower than that in ALI group(P＜0.05);Protein level and MPO activity in BALF and TLW in wortmannin group were significantly higher than that in insulin group(P ＜ 0.05)．Protein levels of α-，β-and γ-ENaC in ALI group were significantly lower than that of control group(0.33±0.06 vs 1.27±0.07，0.18±0.04 vs 0.72±0.04，0.37±0.04 vs 0.69±0.05)(P＜0.05)．Protein levels of α -ENaC(2.19±0.04)，β-ENaC(1.18 ±0.07)and γ-ENaC(1.18 ±0.08)in insulin group were significantly higher than that of ALI group(P＜0.05)．Protein levels of α-ENaC(0.86 ± 0.09)，β-ENaC(0.58 ±0.05)and γ-ENaC(0.59 ±0.02)in wortmannin group were significantly lower than that of insulin group(P＜0.05)．The mRNA level of ENaC and p-Akt in insulin group were significantly higher than that of ALI group(P＜0.05);The mRNA level of ENaC and p-Akt in wortmannin group were significantly lower than that of insulin group(P＜0.05)．ConclusionsActivation of PI3K/Akt signaling pathway up-regulates the expression of α-，β-and γ-ENaC to eliminate the pulmonary edema fluid．

actue lung injury;epithelial sodium channel;PI3K/Akt signaling pathway

R 563.8

A

1001-6325(2012)09-1004-05

2011－11－10

2011－12－28

国家自然科学基金(30971303)

*通信作者(corresponding author):wangdaoxin1@163．com