高效液相色谱法测定叶酸水解制备蝶酸的含量*

张 许 刘 卫

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.中国人民解放军第八十八医院，山东 泰安 271000)

蝶酸是叶酸结构的一部分。曹曦元等[1]曾报道蝶酸能拮抗蓖麻毒素(Ricin)A链蛋白，常作为阳性对照药研究化合物拮抗蓖麻毒素A链蛋白的作用。蓖麻毒素A链蛋白具有很强的抑制蛋白质合成的功能，是一种生化武器，目前临床没有有效的解毒剂，而其原料获得和提取、纯化工艺都不复杂[2-3]。所以，研究蓖麻毒素解毒剂具有重要的现实意义。本研究利用叶酸水解实验制备得到蝶酸粗品，初步精制后建立其含量测定方法，为今后的实验提供原料。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 Lablliance高效液相色谱仪，Scientific System,Inc；配有二级阵列管UV6000LP型紫外检测器，Scientific System,Inc；BT124S型电子天平，北京多利斯仪器系统有限公司；甲醇为色谱纯；盐酸、冰醋酸、三乙胺、氨水均为分析纯；蝶酸对照品(≥93%)，购自Sigma公司；蝶酸供试品为本实验室用叶酸水解制得。

1.2叶酸水解试验

1.2.1试验原理 酰胺水解有两种方法，一是酸碱催化，在pH=3或者pH﹥13的条件下可以水解。二是用酰胺水解酶。本实验采用酸性条件下水解。

1.2.2试验步骤 叶酸45 g加蒸馏水300 ml，加HCl溶解成褐色澄清溶液，控制pH值3左右，搅拌加热至80～90℃，水解2.5 h。冷却至室温，抽滤得产物晾干，称重。将第一步水解产物溶于氨水，加少量活性炭煮沸10 min脱色，抽滤，滤液加HCl调pH值至弱酸性，冷却至室温。抽滤得产物，晾干。

1.3色谱条件 色谱柱：PhenomexneC18(250 mm×4.6 mm)，流动相甲醇︰水(含2%醋酸、0.2%三乙胺)为25︰75，流速1 ml/min。样品溶剂为0.375%氨水。波长：285 nm。

1.4对照品及样品制备 准确称取10 mg蝶酸对照品，用0.375%氨水溶解于50 ml容量瓶并定容至刻度，摇匀得0.2 mg/ml对照品。临用前稀释至所需浓度，进样20 μl，以保留时间定性，峰面积定量。准确称取样品50 mg。用0.375%氨水溶解于50 ml容量瓶并定容至刻度，摇匀得1 mg/ml。临用前稀释至所需浓度，进样20 μl，以保留时间定性，峰面积定量。

1.5计算方法 采用外标法测定蝶酸含量，根据公式：m待测物=A待测物×m标准物/A标准物。所以其含量为：m待测物/m样品进样量×100%。A为峰面积，m为药物质量。

2 结果与计算

2.1色谱分离 二极管阵列检测器检测谱图显示在285 nm处有最大吸收，选用本色谱条件，分析效果和保留时间都比较理想(图1～3)。

图1 二极管阵列全波长扫描图

图2 蝶酸粗品

图3 蝶酸标准品

2.2线性试验 精密量取对照品0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml, 置50 ml量瓶中，用0.375%氨水溶解并定容, 摇匀，得1.6，3.2，4.8，6.4，8，9.6 μg/ml溶液。在上述色谱条件下分别进样测定, 记录色谱图。以进样量(μg)为横坐标,峰面积A为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程,结果见图4。

图4 蝶酸线性方程标准曲线

回归方程为:y=463589x + 52911，相关系数为r=0.9991，表明蝶酸在1.6～9.6 μg浓度范围内呈良好线性关系。

2.3精密度试验 吸取对照品溶液8 μg/ml和4 μg/ml按上述色谱条件连续进样6次，每次20 μl，结果见表1，RSD分别为1.15%和1.73%。

表1 精密度实验结果

2.4稳定性试验 取供试品配制成浓度为20 μg/ml的溶液按上述色谱条件分别在0，2，4，6，8，10，12小时进样，结果见表2，RSD= 0.42%，结果表明蝶酸在12小时内基本稳定。

表2 稳定性试验结果

2.5含量测定 取8 μg/ml和4 μg/ml的蝶酸标准液，各自峰面积平均值为A1标准物和A2标准物，20 μg/ml的样品稳定性试验平均值为A待测物，根据公式测得蝶酸含量为72.5%和73.5%。取平均值73%。

2.6加样回收率试验 称取粗品6份，分别加入3 mg蝶酸标准品，按样品溶液制备方法操作得加样回收溶液，按上述色谱条件操作进样，结果见表3，平均回收率为98.9%，结果表明本方法回收率较高。

表3 加样回收试验结果

3 讨 论

蝶酸由于其溶解性不好，限制了其开发利用[4]，所以现在多用于做对照品，目前也没有报道改变其溶解度的研究，可能因为蝶酸在市面上难以购买。本实验用叶酸水解制备蝶酸得到的粗品，操作步骤简单，试剂成本低，适用于实验室小量合成，虽然纯度不高，根据需要再进一步纯化基本能满足下一步实验的要求。含量测定方法参考叶酸的标准，但大部分叶酸的测定标准都采用磷酸盐为流动相，其配置和冲洗色谱柱的过程繁琐，且对色谱柱的损害也比不含盐的流动相损害严重，本实验采用的流动相简单易配置，省时省力又延长了色谱柱的使用寿命。经过多次实验证实灵敏度高，选择性好，无干扰，结果令人满意。

[1] 曹曦元，赵青，黎燕，等. 蝶酸对天然蓖麻毒素及重组蓖麻毒素A链蛋白的拮抗作用研究[J].军事医学科学院院刊，2010，34(1)：12-15.

[2] 郑成，雷德柱，雷雨，等. 蓖麻毒蛋白提取[J].广东化工，2003(5):1-4.

[3] 余涛，唐吉军，郝兰群，等. 一种纯化蓖麻毒素的新方法[J].生物技术，2005，15(5)：53-55.

[4] Yan X, Hollis T, Svinth M, et al. Structure-based identification of a ricin inhibitor[J]. J Mol Biol, 1997, 266(5):1043-1049.