不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因的克隆与序列分析

吴红艳，陈飞，关艳丽，方新，于淼

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000)

胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase，CHO)是胆固醇降解代谢过程中的第一个酶。它能够催化胆固醇生成终产物4-胆甾烯-3-酮，同时将脱下的氢与氧气生成H2O2。在临床上胆固醇氧化酶与胆固醇脂酶和过氧化氢酶一起作为血浆总胆固醇含量的检测试剂，用以诊断冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病;在食品行业常用它来降低食品中胆固醇含量，制造保健食品;同时，它又是一种新型、高效杀虫剂，对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目、同翅目等害虫都有毒杀作用，尤其对鞘翅目棉铃象甲具有极强的毒杀能力。研究人员已经从好几种微生物中分离到胆固醇氧化酶基因［1］，如甾短杆菌、链霉菌、分枝杆菌和红球菌等。不吸水链霉菌梧州新亚种是由辽宁省微生物科学研究院自行筛选的、具有自主知识产权的新菌株［2］，经研究具有产生胆固醇氧化酶的能力，但是产量较低，常规的方法很难大幅度提高酶产量，所以制约了它的生产和应用。本研究目的是以不吸水链霉菌梧州新亚种基因组DNA作为模板［3］，利用已知的胆固醇氧化酶基因的保守序列设计简并引物进行PCR扩增，PCR产物与载体连接、转化，构建重组质粒，为不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因的诱导表达提供可靠的实验数据并打下良好的理论基础［4］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种供体菌:不吸水链霉菌梧州新亚种(Streptomycesahygroscopicussubsp.wuzhouensis n.subsp)，辽宁省微生物科学研究院提供;宿主菌:E.coli DH5α。

1.1.2 质粒载体PUC18。

1.1.3 培养基LB培养基。

1.1.4 试剂酶类、DNA纯化试剂盒、感受态细胞制备剂、低熔点琼脂糖等。

1.1.5 仪器高速冷冻离心机、超纯水系统、PCR仪(Appolied Biosystems)、核酸电泳、紫外透射反射分析仪等。

1.2 方法

1.2.1 不吸水链霉菌梧州新亚种基因组DNA提取溶菌酶破壁法。

1.2.2 不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因的PCR扩增引物的设计与合成［5］:利用相关的分子生物学软件，通过分析比较GenBank中已知的胆固醇氧化酶基因序列，获得胆固醇氧化酶基因保守序列信息［6］，设计并合成一对简并引物，用来从不吸水链霉菌梧州新亚种基因组DNA中扩增胆固醇氧化酶基因片段，简并引物序列如下:上游引物序列:5'-GG GGATCCGGAATTCGTSGGYGGSGGYTCSCTC-3'，下游引物序列:5'-CC GAATTCCGGGATCCGCTCBGCBWGMGCSGYGAT-3'。PCR扩增反应体系为20 μL，反应体系为多次试验研究确定，模板、4NTP和引物分别为2 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，Taq酶0.5 μL，反应条件:94℃，30 s;71℃，3 min;30个循环，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因片段回收、纯化应用DNA纯化试剂盒［7］。

1.2.4 阳性转化子的筛选与鉴定将PCR扩增产物用BamHⅠ、EcoRⅠ2种内切酶进行分步双酶切，并将质粒载体PUC18同样酶切。酶切体系为10 μL，酶切条件(分步双酶切):温度37℃时间2 h/步。将PCR扩增产物酶切片段与同样酶切后的质粒载体进行连接、转化，连接产物转入大肠埃希菌E.coli DH5α中进行阳性转化子的筛选，连接体系为20 μL，连接条件为4℃过夜。转化:将连接产物转入新制备的大肠埃希菌E.coli DH5α感受态细胞中进行阳性转化子的蓝白筛选。挑取蓝白筛选中的白斑和蓝斑作为对照样品接种于液体含Amp+的LB培养基中，37℃恒温振荡培养24 h，提取质粒，用EcoRⅠ和PstⅠ进行双酶切鉴定。

1.2.5 阳性转化子的序列测定酶切鉴定正确的转化子进行序列测定和分析［8］。

2 结果与分析

2.1 不吸水链霉菌梧州新亚种基因组DNA提取结果

得到足够浓度的基因组DNA。

2.2 不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因的PCR扩增结果

不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因的PCR扩增结果见图1。

2.3 不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因片段的回收、纯化结果

不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因片段的回收、纯化结果见图2。

图2 PCR琼脂糖凝胶电泳扩增胆固醇氧化酶基因片段回收、纯化结果Fig.2 Result of purification

2.4 阳性转化子筛选及鉴定结果

阳性转化子筛选及鉴定结果见图3。

图3 阳性转化子酶切鉴定结果Fig.3 Result of macrorestriction of positive transformant

3 讨论

利用浓度较高的基因组DNA作为模板进行PCR扩增;由PCR扩增后电泳检测结果看出5、7号样品条带清晰，浓度较高，扩增条件适宜，所得到的扩增产物可以进行回收纯化;由纯化后电泳结果看出3个不同大小的条带纯化后纯度很好，可以进行下一步试验;由阳性转化子筛选鉴定结果可以初步确定1号重组质粒为阳性转化子，可以进行序列测定。

根据序列测定结果进行序列分析，基因全长为1 186 bp，去除载体序列序列长度为1 136 bp，NCBI中blast结果，此基因片段序列与Acidovorax avenae subsp.citrulli AA基因序列具有42.1%的同源性，与Syntrophobacter fumaroxidans MPOB，c基因序列具有44.1%的同源性，与天蓝色链霉菌基因序列具有44.1%的同源性。根据文献报道，链霉菌属具有产生胆固醇氧化酶的能力，而此重组菌是否具有产生胆固醇氧化酶的能力还有待于进一步将序列中ORF进行分析［9］、PCR扩增，与表达载体如质粒PIJ702连接后转入链霉菌中进行表达，并对胆固醇氧化酶活性进行测定后才能确定［10］。

［1］ 钟学敏，孙艳，张玲，等.胆固醇氧化酶分离纯化及应用的研究进展［J］.生物技术通报，2009，(4):44-49.

［2］ 刘卫德，蒋细良，冀颖，等.不吸水链霉菌ZBO1 cyp107z基因的克隆及原核表达纯［J］.微生物学报，2011，51(3):410-416.

［3］ 赵红岩，李莉，桓明辉，等.不吸水链霉菌梧州新亚种基因组文库的构建［J］.微生物学杂志，2009，29(1):65-69.

［4］ 张璧，李莉，陈飞，等.不吸水链霉菌梧州新亚种限制修饰系统初探［J］.微生物学杂志，2008，28(2):65-68.

［5］ 张玲，霍惠芝，沈微，等.甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠埃希菌中的表达［J］.生物加工过程，2008，(1):21-26.

［6］ 侯思名，张薇，翟书华，等.云南药用野生稻BIBAC文库的构建及分析［J］.湖南农业大学学报(自然科学版)，2011，37(1):17-21.

［7］ 褚澄，薛利军，赵忠新.脑特异性分子标志物vsnl1基因的克隆及原核表达［J］.扬州大学学报，2008，29(2):11-15.

［8］ 谢青轩，彭琦，刘春林，等.白菜型油菜BraSDG8基因的克隆与序列分析［J］.湖南农业大学学报(自然科学版)，2011，37(4):372-375.

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［10］ 刘雪，范运梁，杜中亮，等.1株产胆固醇氧化酶的不动杆菌的筛选鉴定及特性研究［J］.生物技术，2010，20(3):80-83.