CIK细胞联合化疗治疗儿童中晚期视网膜母细胞瘤的安全性及初步疗效观察

苗丽霞，李 明，王亚峰，孙岩峰，王 军，袁海莲，李彦珊，刘红艳，刘秋玲

CIK细胞联合化疗治疗儿童中晚期视网膜母细胞瘤的安全性及初步疗效观察

苗丽霞1，李 明2，王亚峰1，孙岩峰1，王 军1，袁海莲1，李彦珊1，刘红艳1，刘秋玲1

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine－induced killer cells，CIK细胞)联合化疗治疗中晚期视网膜母细胞瘤的安全性和近期疗效。方法选取30例D期后视网膜母细胞瘤患儿为研究对象，15例行化疗(对照组)，15例行CIK细胞输注联合化疗(联合组)。在化疗前取联合组患儿自体外周血10～35 ml，体外扩增培养约10 d，隔天1次，分3次回输。观察患儿细胞回输过程中的生命体征，监测细胞回输前及回输后4周左右外周血血常规、生化指标、细胞免疫指标变化及生活质量改善情况、不良反应。结果(1)安全性良好，联合组患儿共接受46个周期的CIK细胞治疗，所有患儿在CIK细胞回输过程中及回输后生命体征稳定。在46个疗程138次的CIK细胞回输过程中，仅有3例次出现发热，24 h后均恢复正常;所有患者未出现过敏反应;肝肾功能、心肌酶结果在细胞回输后未出现显著性变化。(2)在随访期间联合组患儿有效率及疾病控制率(73.3%，93.3%)均较对照组(67.7%，80%)提高，但差异无统计意义。联合组患儿均出现体力增加，食欲改善(P＜0.05)，联合组细胞免疫指标改善，CD4+CD25+比例变化有统计学意义(P＜0.05)。结论在视网膜母细胞瘤患者中进行自体CIK细胞治疗明显改善了患者的近期临床症状，是一种安全的方法。

CIK细胞;中晚期视网膜母细胞瘤;治疗

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内原发性恶性肿瘤，近年来发病率逐年增高，严重威胁患儿的视力和生命。对RB的治疗目前已形成化学减容联合局部治疗为主的模式，但在我国由于RB诊断时多已进入中晚期，因肿瘤巨大，无法进行局部治疗，仅靠化疗难以完全清除病灶，部分患儿仍避免不了眼球摘除甚至眶内容物剜除的手术。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cell，CIK)因其体外增殖速度快、抗肿瘤活性强、抗肿瘤谱广、可以调节并增强机体的免疫功能等优势已逐渐成为抗肿瘤治疗研究的热点［1－4］，并被广泛应用于成人多种恶性肿瘤及少数儿童血液系统肿瘤的治疗。以CIK细胞为基础的过继细胞免疫治疗以其明确的治疗优势已成为继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗模式;但在小儿恶性实体肿瘤中尚未见临床应用的报道。笔者对2010－04至2012－04住院的15例中晚期RB患儿在常规化疗的基础上进行自体CIK细胞治疗，并设立单纯化疗组15例进行对照研究。

1 对象与方法

1.1 对象 在我科住院经临床诊断(部分为病理确诊)的30例中，晚期RB患者(即按IIRC分期均为D期后)分为2组:对照组15例(单纯化疗组)和联合组15例(即化疗联合CIK细胞治疗组)。联合组中男9例，女6例，年龄4～53个月，中位年龄18个月，单眼9例，双眼6例，共21只眼。对照组中男9例，女6例，年龄2～54个月，单眼9例，双眼6例，共21只眼。两组患儿的年龄、性别及肿瘤分期差异无统计学意义。治疗前1个月所有入组患儿未做任何抗肿瘤治疗且未使用免疫增强药，血常规淋巴细胞＞1.5×109/L，心电图正常，肝肾功能无明显异常，肝炎、性病抗体均为阴性，预计生存期＞6个月。本临床试验的程序经医院伦理委员会审查批准，治疗前均取得患儿家长的同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 RB患者外周血T亚群检测 联合组RB患者治疗前及治疗2疗程后4周采集外周血2 ml，以肝素抗凝，24 h内送检，采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群。所用仪器为美国BD公司FACSCalibur型流式细胞仪，单克隆抗体为美国BD公司的BD Tritest产品。

1.2.2 RB患者化疗方案 长春新碱1.5 mg/m2，d1;依托泊苷 150 mg/m2，d1、d3;卡铂 560 mg/m2，d1。对照组按上述方案行单纯化疗。联合组化疗前1 d抽取外周静脉血培养CIK细胞，化疗后(即采血后11 d)行CIK细胞回输。每4周为一个疗程，2个疗程后评价初步疗效。

1.2.3 CIK细胞的制备及回输 联合组行化疗前根据患儿体重的不同抽取自身外周静脉血15～35 ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，在体外用多种细胞因子(CD3McAb、IL－2、IFN － γ、IL－1α等)的培养液中进行培养扩增，经过10 d诱导扩增后获得CIK细胞。经微生物及细胞活性检测合格后，经静脉分3次回输给患儿，每隔1 d回输1次。

1.2.4 疗效及安全性评价 近期疗效按照实体瘤治疗疗效评价标准RECIST［5］进行评价，分为完全缓解(complete remission，CR):可测量的病灶完全消失，维持 4周以上;部分缓解(partial remission，PR):可测量的病灶最大直径及最大垂直径的乘积缩小≥50%，无新病灶出现;稳定(stable disease，SD):可测量的病灶两径线乘积缩小＜25%或增大＜25%，无新病灶出现;进展(progressive disease，PD):可测量病灶的两径线乘积增大＞25%，或出现新的病灶。有效率(response rate，RR)=［(CR+PR)/治疗患者总数］×100%;以CR+PR+SD计算疾病控制率(disease control rate，DCR)。随访过程中每个疗程前后进行血常规、生化及淋巴细胞亚群、神经元烯醇化酶检查。每个疗程前均拍眼底照片，治疗前及2个疗程后行核磁、眼部超声、外周血T、B淋巴细胞亚群检测。按照WHO化疗毒副反应作用分级标准，观察回输过程中及回输后的不良反应，直至不良反应消失或接受其他治疗。

2 结 果

2.1 CIK细胞联合化疗的安全性评价 在15例RB患儿的46例次CIK细胞回输过程中及回输后，3例次出现发热，发热时间均在输注细胞后8 h内。其中1例次为高热，最高39℃，无任何伴随症状，口服退热药后热退至正常，且未再出现发热。2例次为低热，低于38℃，未予退热药处理，经过多次饮水，24 h内体温均恢复正常。未出现皮疹及变态反应。所有患儿的肝、肾功能及心肌酶、心电图在CIK细胞治疗后与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05，表 1)。

2.2 CIK细胞联合化疗的近期疗效

2.2.1 生活质量 对照组中，化疗后所有患儿均出现精神反应差、活动耐量下降，食欲缺乏。在联合组中，和使用CIK前及对照组相比，CIK应用2疗程后联合组全部患儿均精神好转，活动耐量增加，食欲明显增加，化疗耐受性提高。差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表1 儿童视网膜母细胞瘤两组治疗后生化指标异常人数比较 (n)

表2 儿童视网膜母细胞瘤两组近期症状改善情况比较(n)

2.2.2 有效率及疾病控制率 两组RB患儿中位随访13个月(5～24个月)，近期疗效见表3。至随访结束，对照组患儿有效率66.7%(10/15)，疾病控制率为80%(12/15);联合组患儿有效率为73.3%(11/15)，疾病控制率为93.3%(14/15)。联合组较对照组有效率和疾病控制率有所提高，但差异无统计学意义。

表3 儿童视网膜母细胞瘤两组近期疗效比较 (n)

2.2.3 CIK细胞联合化疗对患儿外周血T淋巴细胞亚群的影响 联合组15例患儿共接受了46个疗程的CIK细胞治疗，最多5个疗程，最少的2个疗程。其中5个疗程1例，4个疗程3例，3个疗程7例，2个疗程4例。对照组和联合组完成化疗疗程总数相等，最少6个疗程，最多8个疗程。两组患儿治疗前后外周血T淋巴细胞亚群的变化如表4所示，联合组和对照组治疗前各免疫标记比例差异无统计学意义。对照组治疗后外周血中CD3+CD56+百分比均下降，CD8+、CD4+CD25+百分比上升，治疗前后变化均无统计学差异;CD4+比例治疗后明显下降，治疗前后变化有统计学差异(P＜0.05)。联合组CD4+、CD3+CD56+比例在治疗后有所增加，CD8+治疗后略有下降，但无统计学差异;CD4+CD25+比例下降明显，有统计学差异(P＜0.05)。联合组和对照组比较，治疗前CD4+、CD3+CD56+、CD8+、CD4+CD25+百分比无统计学差异;治疗后联合组CD4+、CD3+CD56+比例有所增高，CD8+比例略有下降，但无统计学差异;CD4+CD25+比例下降明显，差异有统计学差异(P＜0.05)。

表4儿童视网膜母细胞瘤两组外周血T淋巴细胞亚群在治疗前和2个疗程后的变化(±s;%)

表4儿童视网膜母细胞瘤两组外周血T淋巴细胞亚群在治疗前和2个疗程后的变化(±s;%)

注:与本组治疗前比较，①P＜0.05;联合组和对照组治疗后比较，②P＜0.05

组别 例数 CD4+ CD8+ CD3+CD56+ CD4+CD25+对照组治疗前 15 36.4 ±9.5 26.3 ±5.3 2.7 ±2.3 2.2 ±1.0治疗后 15 32.6±10.8① 29.4±4.7 2.1 ±1.9 2.4±1.1联合组治疗前 15 34.3 ±11.0 29.4 ±8.1 2.8 ±2.7 2.2 ±1.0治疗后 15 36.8 ±8.4 27.2 ±7.9 3.1 ±2.8 0.9 ±0.8①②

3 讨 论

近年来，随着多学科综合治疗水平的提高，手术及辅助放、化疗大大降低恶性实体肿瘤患儿的肿瘤负荷，使生存率有了明显的提高［6］。但在放、化疗过程中，由于其严重不良反应的存在和晚期肿瘤患儿机体免疫功能低下等因素，导致治疗方案的实施和获益受到了限制［7］。因此，探索新的辅助治疗方法受到了广泛的关注和研究。

CIK细胞治疗是近年发展起来的肿瘤过继免疫治疗。CIK细胞是将患者外周血单个核细胞分离后，在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质性细胞，以 CD3+CD56+共同表达为特点［8］。目前关于CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤机制尚未完全阐明，可能通过黏附因子识别并直接杀伤肿瘤细胞;通过分泌多种抗肿瘤细胞因子发挥免疫介导的间接杀伤作用;亦可诱导肿瘤细胞凋亡及坏死［9－11］。CIK细胞治疗以增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高、非MHC限制、对骨髓造血功能影响轻微等优势，在清除微小肿瘤病灶，提高患者免疫功能，增强放化疗耐受性等方面取得了良好的疗效，且不良反应轻微。目前CIK细胞治疗联合放化疗已应用于成人多种恶性肿瘤及少数儿童血液系统肿瘤的治疗［12－15］。但在儿童实体瘤中，除儿童淋巴瘤外，未曾有CIK细胞治疗的报道。

本研究将CIK细胞与化疗联合应用于中晚期RB患儿的治疗，安全性良好，且取得了初步疗效。CIK细胞回输中常见的不良反应有寒战、发热、肌痛等感冒样症状或胃肠道反应，体温一般不超过38℃，多数可自行消退。本研究中有3例次出现发热，未出现感冒样症状及胃肠道反应，3例次发热均在24 h内缓解，所有患儿肝肾功能、心肌酶及心电图治疗前后无明显变化，初步说明CIK细胞治疗在儿童RB治疗中安全性良好。CIK细胞治疗可以降低化疗的毒性反应，使患儿增加了对化疗的耐受性。本研究在随访期间联合组患儿有效率及疾病控制率(73.3%，93.3%)均较对照组(67.7%，80%)有一定比例提高，但差异无统计学意义，这可能与病例数少，随访时间短有关。

本研究中，对照组治疗后外周血中CD4+在化疗后出现明显下降(P＜0.05)，CD8+则升高，使CD4+/CD8+比值下降。这与肿瘤治疗的相关文献结论一致，一般认为其原因可能是与肿瘤组织释放的一些可溶性物质或免疫抑制因子有关［16］。这些物质经血循环入胸腺后抑制T细胞分化成熟，并诱导T细胞向有利于抑制性T细胞方向分化，从而造成 T细胞亚群 CD3+、CD4+下降，CD8+升高，使CD4+/CD8+比值变小，从而导致细胞免疫功能低下［17］。联合组 CD4+、CD3+CD56+比例在治疗后有所增高，CD8+略有降低，但无统计学意义。这与成人实体肿瘤应用 CIK细胞治疗后 CD4+、CD3+CD56+比例显著增高，CD8+显著降低不同［18，19］。出现此现象可能因病例过少，此外与CIK细胞输注后细胞免疫功能的检测时间延长有关。多数报道细胞免疫检测时间为CIK细胞输注后2周，本研究检测时间是CIK输注后4周。因随着输注后时间的延长，输入体内的存活CIK细胞数量逐渐减少，造成CIK治疗后CD3+CD56+比例增高无统计学意义。CD4+CD25+调节性T细胞，能抑制T细胞对外源和自身抗原的免疫反应，在防止自身免疫性疾病发生的同时也导致了机体对同源肿瘤细胞的免疫无能。本研究显示CIK细胞治疗后CD4+CD25+调节性T细胞比例显著降低(P ＜0.05)，与于渊等［20］报道的在卵巢癌患者中使用CIK细胞治疗的结果一致。CIK细胞治疗通过下调CD4+CD25+调节性T细胞，可以在一定程度上解除其对机体的免疫抑制，提高肿瘤患儿的免疫功能，预防局部复发及远处转移。

综上所述，CIK细胞联合化疗治疗小儿晚期视网膜母细胞瘤具有较好的安全性和初步疗效，可以提高缓解率，增强患儿的免疫功能，降低化疗的不良反应。但由于本治疗费用较高，使得该治疗在肿瘤患儿中的广泛应用受到一定限制。此外，儿童的治疗方案和疗效标准尚待进一步统一和规范。在今后的工作中有待扩大病例及多中心研究来进一步观察过继免疫细胞联合化疗的疗效，并深入探讨其作用机制。

［1］刘秋玲.儿童恶性肿瘤治疗新策略［J］.武警医学，2010，21(8):645 －648.

［2］Schmidt－Wolf I G，Lefterova P，Mehta B A，et al.Phenotypic characterization and identification of effector cells involved in tumor cell recognition of cytokine－induced killer cells［J］.Exp Hematol，1993，21(13):1673－1679.

［3］Hontscha C，Borck Y，Zhou H，et al.Clinical trials on CIK cells:first report of the international registry on CIK cells(IRCC) ［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2011，137(2):305－310.

［4］Linn M A.Intraocular retinoblastoma:the case for a new group classification［J］.Ophthalmol Clin North Am，2005，18:41 －53.

［5］Therasse P，Arbuck S G，Eisenhauer E A，et al.New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors［J］.JNCI，2000，92:205 －216.

［6］鲍萍萍，郑 莹，王春芳，等.2002－2004年上海市儿童恶性肿瘤发病特征［J］.中国肿瘤，2009，18(2):119－120.

［7］Baas P，Belderbos J S.Chemoradiation therapy in non small cell lung cancer［J］.Cur rent Opinion in Oncology，2011，23(2):140－149.

［8］Blattman J N，Greenberg P D.Cancer immunotherapy:a treatment for the masses［J］.Science，2004，305(5681):200－205.

［9］姚 春，宋善俊.脐血CIK细胞对耐药白血病细胞体外杀伤效应及其机制的研究［J］.临床血液学杂志，2008，21(7):369 －372.

［10］刘 苗，吴小艳，金润铭.细胞因子诱导的杀伤细胞生物活性及杀瘤机制［J］.实用儿科临床杂志，2009，24(15):1163－1166.

［11］Pievani A，Borleri G，Pende D，et al.Dual－functional capability of CD3+CD56+CIK cells，a T－cell subset that acquires NK function and retains TCR－mediated specific cytotoxicity［J］.Blood，2011，118(12):3301－3310.

［12］Li J J，Gu M F，Pan K，et al.Autologous cytokine－induced killer cell transfusion in combination with gemcitabine plus cisplatin regimen chemotherapy for metastatic nasopharyngeal carcinoma［J］.J Immunother，2012，35(2):189－195.

［13］Luo H，Zhou X.Researche advances on CIK cells and their clinical use in lung cancer［J］.Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2011，14(12):954 －959.

［14］Titov K S，Gritsa A N，Kiselevski M V ，et al.Biotherapy of malignant peritoneal effusions in ovarian carcinoma［J］.Vopr Onkol，2011，57(4):470 －474.

［15］张乐萍，陆爱东，童春容，等.细胞因子诱导的杀伤细胞/白细胞介素－2治疗儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病疗效观察［J］.实用儿科临床杂志，2003，18(3):185－186.

［16］Zanussi S，Vaccher E，Caffau C，et al.Interferon－gamma secretion and Perforin expression are impaired in CT lymphocytes from patients with undifferentiated carcinoma of nasopharyngeal type［J］.Cancer Immunol Immunother，2003，52:28－32.

［17］张世文，何晓光，李晓江，等.自体CIK细胞治疗对喉癌患者放疗后免疫功能的影响［J］.临床耳鼻喉头颈外科杂志，2011，25(2):61 －63.

［18］周炳喜.细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)在消化道癌中的疗效观察［J］.现代预防医学，2011，38(16):3335－3336.

［19］陈复兴，刘军权，张南征，等.自身细胞因子诱导的杀伤细胞过继性免疫治疗恶性肿瘤的临床观察［J］.癌症，2002，21(7):797 －801.

［20］于 渊，李 岩，荣风年，等.自体CIK细胞治疗对卵巢癌调节性T细胞的影响［J］.山东大学学报(医学版)，2010，48(5):101 －104.

Efficacy and safety of cytokine－induced killer cells(CIK cells)combined with chemotherapy in treating advanced retinoblastoma(RB)

MIAO Lixia1，LI Ming2，WANG Yafeng1，SUN Yanfeng1，WANG Jun1，YUAN Hailian1，LI Yanshan1，LIU Hongyan1，and LIU Qiuling1.1.Pediatric Department;2.Office of Medical Affairs，the General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039，China

ObjectiveTo study the efficacy and safety of cytokine－induced killer cells(CIK cells)combined with chemotherapy in treating advanced retinoblastoma(RB).Methods Thirty child patients with RB at stage D were enrolled for the study.15 patients

chemotherapy(control group)while the rest were treated with CIK cells infusion combined with chemotherapy(study group)，from whom 10－35 ml autologous peripheral blood was taken before chemotherapy to culture CIK cells in vitro for about 10 days.CIK cells were reinfused every other day three times.The vital signs in the process of cell reinfusion were observed.Changes of peripheral blood indexes，biochemical indexes，immunity indexes，life quality and side effects were also monitored four weeks after the reinfusion.Results (1)CIK cells reinfusion was safe.15 patients received a total of 46 cycles of CIK cells therapy.Vital signs of all the children were stable.During the 46 courses(138 times)of CIK cells reinfusion，only three cases of patients had a fever during the first 24 hours.No patients had any allergic reactions.With regard to liver and kidney functions and cardiac enzymes，no obvious difference was observed before and after the reinfusion.(2)During the follow－up period，the efficiency and disease control rate in the study group(73.3% ，93.3%)seemed to be higher than that in the control group(67.7%，80%)，but not significantly different.There was improvement in physical strength，appetite and immunity indexes(P ＜0.05)in the study group.The change in the ratio of CD4+CD25+T cells was significant.Conclusions The autologous CIK cell therapy is safe，which improves clinical symptoms significantly in patients with RB.

CIK cells;advanced retinoblastoma;therapy

刘秋玲，E －mail:wj670@vip.sina.com

R730.5

北京市科委“首都临床特色应用研究”专项课题(Z121107001012055)

苗丽霞，女，1975年出生。硕士，主治医师。主要从事儿童血液肿瘤内科工作。

100039 北京，武警总医院:1.儿科，2.医务部

(2012－05－10收稿 2012－08－02修回)

(责任编辑 梁秋野)