离子色谱－电导检测法测定不同乳制品中硫氰酸盐

张水锋 陈小珍 张东雷 李红艳 陈万勤

（浙江省质量检测科学研究院浙江省食品安全重点实验室，杭州 310013）

离子色谱－电导检测法测定不同乳制品中硫氰酸盐

张水锋 陈小珍＊张东雷 李红艳 陈万勤

（浙江省质量检测科学研究院浙江省食品安全重点实验室，杭州 310013）

建立了离子色谱－电导检测分析不同类型乳制品中硫氰酸盐（SCN－）污染物的方法，重点研究了不同形态样品如固态类（奶粉）、液态类（牛奶）、凝固态类（凝固型酸奶）和半流质态类（炼乳）等乳制品中的硫氰酸盐前处理方法，采用丙酮作为蛋白沉淀剂，有效实现了对各类样品中蛋白质的沉淀和对硫氰酸盐的提取，避免了以往采用乙腈处理样品时容易分层的弊端，方法在0～5.0mg／L浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r为0.9997（n＝6），方法检出限（LOD）为0.15～0.5μg／g，方法回收率为95.0%～105.0%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～5.6%（n＝3）。

硫氰酸盐；乳制品；离子色谱；电导检测；前处理；食品安全

1 引言

在20世纪80年代，受制冷技术限制硫氰酸钠曾被作为保鲜剂而在乳品行业广泛应用。但由于硫氰酸钠对人体具有较大毒性，自2008年12月起，卫生部已将硫氰酸钠列入非法食品添加物质名单。因此，为了确保食品安全亟需发展乳制品中硫氰酸盐污染物的检测方法。

目前，已报道的用于测定硫氰酸根（SCN－）的方法主要有荧光动力学法［1］、电化学法［2－3］、流动注射法［4］、高效液相色谱法［5］、毛细管电泳法［6］、气相色谱法［7］等。离子色谱法［8－10］测定SCN－具有无须衍生、操作简单、响应稳定等优点而备受关注。已报道的有关离子色谱测定乳制品中SCN－含量的文献主要讨论乙腈的前处理效果，而对采用不同有机溶剂处理样品方面的研究报道得较少。本课题组研究了多种溶剂对全脂奶粉的前处理效果，确定了以丙酮作为蛋白沉淀剂的样品前处理方法［11］，可有效避免乙腈沉淀蛋白质时溶液分层现象。研究中就不同类型如固态类（奶粉）、液态类（牛奶）、凝固态类（凝固型酸奶）、半流质态类（炼乳）等样品的前处理方法进行了探讨，开发了基于丙酮沉淀蛋白的各种乳制品的离子色谱分析方法及样品前处理方法。方法稳定可靠、通用性好，适合各类乳制品中硫氰酸盐残留量的质量监控。

2 实验部分

2.1 试剂与材料

实验用水均为Millipore超纯水机制备的去离子水；所用试剂主要有乙腈（分析纯）、甲醇（色谱纯）、丙酮（分析纯）、硫氰酸钾（优级纯）、无水乙醇（优级纯）均为国药集团化学试剂有限公司产品。

硫氰酸根（SCN－）标准储备液（1 000μg／mL）：将硫氰酸钾标准品于80℃烘箱内烘干2h。准确称取干燥后的硫氰酸钾1.6732g于1 000mL容量瓶中，定容、混匀。

SCN－标准工作溶液：移取适量SCN－标准储备液稀释至所需浓度而得。

固相萃取小柱：DIKMA C18（500mg／6mL）为迪马公司产品。

一次性水系（纤维素）、有机系（尼龙）针式滤膜（0.45μm，天津市恒奥科技发展有限公司）。

2.2 仪器

DX－600离子色谱系统（美国戴安公司），配备AS40自动进样器、淋洗液自动发生器、电导检测器和抑制器；BIOFUGE STRATOS高速冷冻离心机（美国Thermo）；WH－861旋涡混合仪（太仓市华利达实验设备有限公司）；DS－3510DTH超声波仪（上海生析超声仪器有限公司）。

2.3 实验方法

2.3.1 色谱条件

色谱柱为阴离子交换柱IonPac AS16，4.0mm× 250mm分析柱；IonPac AG16，4.0mm×50mm保护柱。流动相为KOH溶液（由淋洗液在线发生器在线生成），梯度淋洗模式（0～5.0min，40mmol／L；5.1～13.0min，60mmol／L；13.1～18.0min，40mmol／L）；流速为0.8mL／min。抑制器为抑制电流139mA，自抑制模式，柱温为30℃，检测池温度30℃，定量环体积为100μL，满环进样。

2.3.2 样品前处理方法

固相萃取小柱活化：将C18固相萃取小柱依次用5mL甲醇，10mL去离子水进行活化处理，待用。

固态类样品（如奶粉等）：称取样品约1.0g（精确至0.0001g）于10mL具塞比色管中，加入去离子水4.0mL，旋涡1min，超声提取5min。用丙酮定容至10mL，旋涡混合1min，转移至50mLPVC高速离心管中，于12000r／min、4℃下高速离心15min。取上层清液1mL稀释10倍，过处理好的C18固相萃取小柱去除脂肪、有机酸等干扰物质，弃去前面滤液约2mL，接取后段滤液过0.45μm针式有机系滤膜后上机测试。

凝固态类样品（如凝固型酸奶等）、半流质态类样品（如炼乳等）：称取约2.0g样品（精确至0.0001g）于10mL具塞闭塞管中，加入2mL去离子水，旋涡混匀，超声5min，用丙酮定容至10mL（丙酮量约为5mL），旋涡混匀，转移至50mLPVC高速离心管，于4℃、12000r／min下高速离心15min，取上层清液1mL稀释10倍，过C18固相萃取小柱，弃去前面2mL流出液，接取后面的流出液，并过0.45μm针式有机系滤膜后上机测试。

液态类样品（如牛奶等）：称取约4.0g（精确至0.0001g）样品于10mL具塞比色管中，用丙酮定容至10mL刻度线（丙酮用量约为5～6mL），旋涡混匀，超声5min，转移到50mLPVC高速离心管中，于4℃、12000r／min下高速离心15min，取上清液1mL稀释10倍，过C18固相萃取小柱，弃去前面2mL流出液，接取后面的流出液，并过0.45μm针式有机系滤膜后上机测试。

3 结果与讨论

3.1 前处理方法的确定

为了定量计算方便，根据最终产品的形态将乳制品分为固态类（如奶粉）、液态类（如牛奶）、凝固态类（如凝固型酸奶）、半流质态类（如炼乳）四类。鉴于硫氰酸盐无机盐的属性和离子色谱的特点，样品前处理的基本原则是：首先用去离子水对目标物进行提取，再采用有机溶剂沉淀蛋白质，进而用固相萃取小柱去除脂肪等有机物，得到测试液。

对于奶粉等固体样品，硫氰酸盐以固体形式存在，宜先加入去离子水对其进行提取；然后再对蛋白质进行沉淀，加入去离子水的量以样品与水的质量比1∶4为佳。

对于凝固型酸奶、半流质的炼乳等样品，硫氰酸盐的存在方式较为复杂，也宜先加入适量去离子水对样品进行分散提取，加入去离子水的量以质量比1∶1为佳。

而对于牛奶等液体样品，硫氰酸盐以离子形式存在，可直接加入蛋白沉淀剂进行处理。

实验中也考察了“加水提取步骤”的影响，奶粉样品中不加水直接用丙酮提取测得值仅为加水提取处理的15.6%。对于凝固型酸奶样品，不加水处理测得值是加水处理的87.8%。可见，加水步骤在处理上述两类样品时具有重要意义。

3.2 蛋白沉淀剂选择

蛋白沉淀剂的优化选择是影响后续离子色谱分析性能的重要因素。考察了不同有机溶剂甲醇、乙醇、乙腈、丙酮对样品的前处理效果，实验表明甲醇和乙醇的处理效果不如乙腈、丙酮对蛋白质沉淀得彻底。但乙腈在处理样品时，溶液在低温时容易分成上下两层，导致无法准确定量。采用丙酮处理样品，蛋白质沉淀彻底，并且不存在分层现象。通过对丙酮加入体积的优化得到，对于不同类型的乳制品，按“2.3.2样品前处理”进行取样时，加入丙酮的体积以5～7mL为佳。图1（A）是在优化条件下标准溶液（0.5μg／mL）的标准色谱图，图1（B）是实际样品的色谱图。

图1 硫氰酸盐标准色谱图（A）和实际样品的色谱图（B）Figure 1.Chromatograms of 0.5g／mLstandard solution（A）and real samples（B）.

3.3 超声处理时间

实验发现，超声处理对固态、凝固态、半流质态等样品提取SCN－过程有较大影响。实验考察了超声时间在0～20min范围内对实验的影响，结果表明，采用超声处理时间为5min时，即可实现对样品中硫氰酸盐的有效提取。

3.4 不同滤膜对测定的影响

分别考察水系滤膜、有机系滤膜对检测结果的影响，实验表明，水系滤膜对硫氰酸根具有较强的吸附作用，如图2所示，对0.5μg／mL的标准溶液采用水系滤膜过滤后上机测试，所得结果仅为0.17μg／mL，浓度下降66%。因此前处理过程中采用水系滤膜过滤样液，则会导致测定结果偏小。而采用有机系滤膜处理样品，对测定结果影响较小。

3.5 线性范围、回收率和方法精密度

配制SCN－标准曲线的浓度分别为0.0、0.05、0.5、1.0、2.0、5.0mg／L，直接进样测定相应的峰面积，对“SCN－浓度（y）－峰面积（x）”作标准曲线。在给定范围内，浓度和峰面积呈线性响应，其线性方程为：y＝0.709x－0.009（n＝6），相关系数r＝0.9997。根据“2.3.2样品前处理方法”对样品的分类，以3倍信噪比计，固态类、液态类、凝固态类、半流质态类样品的检出限（LOD）分别为0.5、0.15、0.25、0.25μg／g。

分别称取4.0g（精确至0.0001g）鲜牛奶、1.0g（精确至0.0001g）奶粉、2.0g（精确至0.0001g）凝固型发酵乳样品3批，分别按表1进行加标回收实验，结果如表1所示，方法回收率为95.0%～ 105.0%，RSD为1.4%～5.6%（n＝3）。

图2 滤膜吸附对测定结果的影响Figure 2.Effects of the membrane absorption on the peak heights.

表1 方法回收率实验Table 1 Spiked recoveries of SCN－in the samples（n＝3）／（μg·g－1）

3.6 实际样品测定

用离子色谱法对4类乳制品（每类4批样品，每批分别测定3次取平均值）进行检测，结果列于表2。从表2可知，所检测的实际样品中均含有一定量的SCN－，其含量在0.9～17.9mg／kg范围内。有研究表明［15］牛奶中本身会含有一定水平的SCN－，其含量受奶牛品种、个体、饲养方式等因素影响有很大差异；而牛奶经过浓缩制成其乳制品，其天然存在的SCN－含量会相应提高。

表2 样品中SCN－的浓度（n＝3）Table 2 SCN－Concentrations in real samples（n＝3）（mg·kg－1）

4 结论

根据乳制品的不同形态（固态、液态、凝固态和半流质态），分别建立了各类型产品的样品中SCN－的前处理方法，并采用离子色谱－电导检测法进行分析，方法快捷方便、实用可靠，为全面监测乳制品中硫氰酸盐污染物提供了可靠的分析手段。

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［11］张水锋，林珍珍，陈小珍，等.基于离子色谱／电导检测的全脂奶粉中硫氰酸盐污染物的测定及前处理方法研究［J］.分析测试学报，2012，31（1）：85－89.

Determination of Thiocyanate Contaminant in Different Types of Dairy Products by Ion Chromatography with Conductivity Detection and Sample Pretreatment

ZHANG Shuifeng，CHENXiaozhen＊，ZHANG Donglei，LI Hongyan，CHENWanqin
（ZhejiangKeyLabofFoodSafety，ZhejiangInstituteofQualityInspectionScience，Hangzhou310013，China）

A method was developed for analysis of thiocyanate（SCN－）contaminant in different types of dairy products using ion chromatography with conductivity detection.The focus was on the sample pretreatment for analyzing different forms of dairy products including solid state（milk powder），liquid（milk），condensed state（yoghurt）and semi－liquid state（condensed milk）.Acetone was used to precipitate protein and results showed that acetone can precipitated all kinds of proteins and extract the thiocyanate（SCN－）contaminant and also avoid the stratification problem occurred when acetonitrile was used as the protein precipitant.Under the optimal conditions，the calibration curve was linear in the range of 0～5.0mg／L，with the linear correlation coefficient ofr＝0.9997（n＝6）.And for different types of dairy products，the limits of detection（LOD）were in the range of 0.15μg／g to 0.5μg／g，the recoveries were between 95.0%to 105.0%，and the relative standard variations（RSD）were about 1.4%to 5.6%（n＝3）.

thiocyanate；dairy product；ion chromatography；conductivity detection；pretreatment；food safety

＊通讯作者：陈小珍，女，教授级高工，主要从事食品安全及分析的研究。E－mail：cxz730＠163.com

O657.7＋5；TH833

A

2095－1035（2012）03－0060－04

10.3969／j.issn.2095－1035.2012.03.019

2012－07－02

2012－07－31

浙江省质量技术监督局科技计划项目（20100206，20090208）；浙江省科技计划项目（2009F70033）。

张水锋，男，高级工程师，主要从事食品安全及分析的研究。E－mail：seafling＠163.com