酿酒酵母抗氧化相关基因突变体对黄曲霉毒素B1的清除作用

史 锋， 黄宇啸， 李永富

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 214122）

酿酒酵母抗氧化相关基因突变体对黄曲霉毒素B1的清除作用

史 锋1， 黄宇啸1， 李永富＊2

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 214122）

黄曲霉毒素（AF）是粮食作物和饲料原料中容易污染的一种强毒性和强致癌性物质，酿酒酵母具有毒素清除功能。利用HPLC分析了酿酒酵母野生菌BY4742及三株关键的抗氧化相关基因缺失菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ对黄曲霉毒素B1的清除能力。结果表明，在PBS缓冲液中存活和死亡的细胞对AFB1的清除率分别为74%～76%和71%～73%，说明酵母细胞对AFB1的清除以生物吸附作用为主。在培养基中，3种突变菌活细胞对AFB1的清除率发生不同程度的降低，其中glr1Δ的AFB1清除能力下降最明显，其次是sod2Δ，而zwf1Δ下降最少，说明这些关键的抗氧化基因的缺失会影响细胞在生长状态下对AFB1的清除作用。

黄曲霉毒素；酿酒酵母；抗氧化基因；生物脱毒

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是黄曲霉菌（Aspergillus flavus）、寄生曲霉菌（A.parasiticus）等在适宜的温度、湿度及氧气条件下产生的次级代谢产物［1］，广泛存在于污染的粮食作物和饲料原料中，尤以霉变的花生、玉米及谷类含量最多。AF的污染是全球性的，在发展中国家尤为严重［2］。1993年AF被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物，是目前认为的毒性和致癌性最强的天然毒素之一，在食品中的最高限量被规定为30μg／kg。AF具有致癌、致突变、致畸和免疫抑制作用，并兼具急性毒性和慢性毒性，尤会引发肝癌，因此对全民的健康危害很大。更为严重的是，AF的耐热性很强，100℃加热20 h也不被全部破坏，280℃高温下才会裂解，通常的烹调条件不能对其产生破坏。AF有多种结构形式，包括 AFB1、AFB2、AFGl、AFG2、AFM1、AFM2等，其中 AFB1是毒性最强、也是食品中污染最多的AF。

由于AF的污染情况越来越令人担忧，因此迫切需要寻找有效的方法来控制和去除AF。这可以通过提高谷物的质量和储存状况来达到，也可以用各种吸附剂改变毒素在人体中的可得性［3］，即通过防霉变、去毒素两方面来完成对AF的控制和清除。防霉变主要包括选育抗霉菌的优良品种生产农作物，控制霉菌生长所需的湿度、温度及氧气等条件，以及利用霉菌吸附剂或化学防霉剂防止霉菌污染等。去毒素主要包括利用化学或生物方法对AF进行体外体内吸附或转化，如多孔性真菌毒素吸附剂、益生菌或其结构成分、腐殖酸、叶绿酸等；或通过干预人体内的毒素代谢酶来调节毒素在体内的代谢活化与解毒过程。

在这些方法中，采用益生菌如乳酸菌、双歧杆菌、酿酒酵母等对AF进行生物吸附或转化具有独特的优势。益生菌不仅可以在体外清除AF，还可能在动物细胞内或动物体内清除AF［4－5］。益生菌结合AFB1后对肠粘液的结合力下降，从而可携带AFB1从肠道解离，并最终排出体外。酿酒酵母是重要的工业发酵微生物，在工业酿造产品如葡萄酒中，它能去除微量的生物毒素，如赫曲霉毒素A的污染［6］。酿酒酵母还能减少AFB1对小鼠的毒性，并显示出对污染玉米中AFB1的强效吸附能力［7］。有研究表明，酿酒酵母的压力感应基因被破坏后，对真菌毒素变得敏感［8］。由于氧化压力是酿酒酵母面临的主要压力之一，酿酒酵母拥有一套由多种还原剂和多种酶、蛋白质组成的氧化压力反应系统，为了了解这个系统在毒素清除中的作用，分析了酿酒酵母野生菌BY4742与3株关键的抗氧化基因缺失菌在不同存活状态下对AFB1的清除能力。

1 材料与方法

1.1 培养基

YPD培养基：质量浓度为1 g／d L的酵母抽提物，2 g／d L胰蛋白胨，2 g／d L葡萄糖，p H 值5.0，需要时添加0.2 mg／m L G418。固体培养基中加入2 g／d L琼脂。

1.2 酿酒酵母菌株

研究所用酿酒酵母菌株均来自于EUROSCARF。突变菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ是在野生菌BY4742的基础上，分别以kanMX4置换ZWF1、SOD2或GLR1基因而构建出的基因缺失体。

1.3 酵母细胞对AFB1的结合能力测试

2 mg／m L AFB1储液：将1 mg AFB1（Sigma）分散 于 0.5 m L 苯－乙 腈 （97∶3）中；2μg／m L AFB1－PBS溶液：将2 mg／m L AFB1储液用 pH 7.3，0.1 mol／L PBS缓冲液稀释1 000倍；2μg／m L AFB1－YPD培养基：将2 mg／m L AFB1储液用YPD培养基稀释1 000倍。

各种酵母细胞在YPD培养基中培养至对数期中末期，收集1×108个细胞，用无菌水洗后，分散于1.0 m L 2 μg／m L AFB1－PBS 溶 液 或 2 μg／m L AFB1－YPD培养基中，30℃静置保温一定时间，收集上清，用于测定未被活细胞结合的AFB1含量。细胞沉淀分散于PBS中，振摇保温，收集上清，用于测定活细胞结合的AFB1含量。

另外，在收集了1×108个细胞并洗后，1×105Pa灭菌30 min，将细胞分散于1.0 m L 2μg／m L AFB1－PBS溶液中，30℃静置保温一定时间，测定未被死细胞结合和死细胞结合的AFB1含量。

1.4 AFB1的HPLC分析

将收集的样品冷冻干燥24 h，然后各加入200 μL正己烷和200μL三氟乙酸，立即旋紧盖子，涡旋30 s。在40℃烘箱中衍生15 min，之后用氮气吹干混合物，加入400μL水－乙腈（体积比85∶15）溶解残余物并涡旋30 s，离心取上清，进行HPLC（安捷伦1100）分析［9］。

HPLC色谱柱：Benetnach ODS（4.6 mm×250 mm×12 nm，5μm）；流动相：乙腈－水［乙腈体积分数15%～40%10 min，40%保持10 min］；体积流量：0.7 mL／min；进样量：20μL；柱温：25℃；检测器：荧光检测器；检测波长：Ex 360 nm，Em 440 nm。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母活细胞和死细胞对AFB1的清除能力

为了了解酿酒酵母对AFB1的清除性能是否受细胞存活状态的影响，我们首先测定了酵母活细胞和死细胞在PBS缓冲液中对AFB1的结合能力。

4种酿酒酵母活细胞对AFB1的清除率为74%～76%（图1（a））；经高压灭菌后，4种酵母细胞对AFB1的清除率维持在71%～73%之间（图1（b）），略低于活细胞对AFB1的清除率；且在12 h和24 h时，各菌株对AFB1的清除率也基本保持不变。说明酿酒酵母对AFB1的清除以吸附作用为主，而生物转化作用很弱，这与文献报道的酵母细胞壁就具有真菌毒素脱毒功能相一致［10］。

图1 酿酒酵母对PBS缓冲液中AFB1的结合能力Fig.1 Binding of AFB1 in PBS buffer by Sacchromyces cerevisiae

2.2 酿酒酵母活细胞在培养基中对AFB1的清除能力

考虑到在缓冲液中处于静息状态的活细胞和在培养基中处于生长状态的活细胞可能会具有不同的AFB1清除能力，于是我们又测定了在YPD培养基中，野生菌BY4742和3种与抗氧化有关的基因缺失菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ对溶液内 AFB1的结合能力，结果见图2。

图2 酿酒酵母活细胞对溶液中AFB1的结合能力Fig.2 Binding of AFB1 in different solution by viable cells of Sacchromyces cerevisiae

在PBS缓冲液中，各酿酒酵母活细胞对AFB1的结合率都在12 h达到最大，12～48 h内基本保持稳定，维持在74%～76%之间（图2（a））。而在YPD培养基中，BY4742、zwf1Δ、sod2Δ3种菌株对AFB1的结合率也在12 h达到最大，但glr1Δ对AFB1的结合较慢，24 h才达到最高；这四种菌株在24 h之后，对AFB1的结合率都有所下降，从82%～48%降低至75%～31%（图2（b））。在YPD培养基中，3种突变菌对AFB1的结合率明显低于在PBS缓冲液中，说明突变菌在YPD培养基中生长时，细胞所面临的氧化压力影响了它们对AFB1的吸附和清除；或是培养基中的某些成分干扰了突变细胞对AFB1的吸附作用，降低了对AFB1的清除效果。但野生菌BY4742在YPD培养基中依然保持着较高甚至更高的AFB1清除能力，说明培养基中的成分并没有影响到野生菌对AFB1的吸附和清除作用。

2.3 酿酒酵母抗氧化相关基因缺失后对AFB1清除能力的变化

对于酿酒酵母野生菌BY4742和3个关键的抗氧化相关基因突变菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ，不管是存活细胞还是死亡细胞，在与PBS缓冲液中的AFB1作用12 h后，它们对AFB1的清除率都几乎相同，野生菌仅略高于突变菌0.9%～2.5%（图3）。说明在PBS缓冲液中，这几种关键的抗氧化相关基因缺失后，并不会显著影响酵母细胞对AFB1的结合和清除能力。

图3 酿酒酵母野生菌和基因缺失菌对AFB1的结合能力Fig.3 Binding of AFB1 by the wild－type and mutant cells of Sacchromyces cerevisiae

但是，当酵母活细胞在YPD培养基中与AFB1作用12 h后，BY4742对AFB1的清除率（82.4%）明显高于zwf1Δ、glr1Δ和sod2Δ，其中glr1Δ对AFB1的清除率大幅下降，为44.8%，其次是sod2Δ（52.7%），而zwf1Δ下降较少，为65.6%（图3）。

酿酒酵母的氧化压力主要来自于有氧代谢中所产生的活性氧。为了抵抗这些活性氧的攻击，细胞建立了一套完善的酶促抗氧化防御体系和非酶抗氧化防御体系。前者主要包括：清除超氧阴离子的超氧化物歧化酶（SOD），以及清除过氧化物或过氧化氢的过氧化物酶、过氧化氢酶等，而过氧化物酶需要还原型谷胱甘肽（GSH）或硫氧还蛋白作为其辅因子［11］。后者主要包括还原态GSH、硫氧还蛋白等分子［12］。而GSH还原态的维持由GSH还原酶催化完成，并需要由NADPH提供还原力。本研究中所涉及的ZWF1基因编码HMP途径的6－磷酸葡萄糖脱氢酶，是细胞内NADPH的主要来源之一［13］；GLR1基因编码 GSH 还原酶，负责 GSH还原态的维持；SOD2基因编码线粒体超氧化物歧化酶，负责清除超氧阴离子。当这3个与抗氧化有关的关键基因缺失后，酵母细胞在生长状态下对AFB1的吸附和清除能力显著下降，尤以GSH还原酶基因GLR1的缺失影响最为严重，其次是线粒体超越化物歧化酶基因SOD2及6－磷酸葡萄糖脱氢酶基因ZWF1。GLR1基因的缺失导致非酶防御体系中还原型GSH的不足，并会减弱酶促防御体系中负责清除过氧化物的GSH过氧化物酶的活性，而SOD2基因的缺失会导致超氧阴离子的过度累积，ZWF1基因的缺失会降低NADPH的供应水平，说明虽然这些基因的缺失与涉及毒素吸附的酵母细胞壁的合成无关，但细胞抗氧化功能出现不同程度的缺陷，影响到对AFB1的清除作用。

3 结语

所测试的几株酿酒酵母不管是在存活状态还是在死亡状态下，都表现出对缓冲液中AFB1的优良的清除能力，清除率达70%以上。但是在培养基中，几种抗氧化相关基因缺失菌对AFB1的清除率表现出不同程度的下降，说明细胞抗氧化功能的缺陷会影响细胞在生长状态下对毒素的吸附和清除作用。野生菌对AFB1的最高清除率可以达到82.4%，提示其在毒素清除方面的应用潜力。

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Detoxification of Aflatoxin B1bySaccharomyces cerevisiaeMutants of Anti－Oxidative Relating Genes

SHI Feng1，HUANG Yu－xiao1，LI Yong－fu＊2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Aflatoxins are a group of mycotoxins with strong mutagenic and carcinogenic properties.Various commodities including crop and feed materials are easy to be contaminated with aflatoxin.Saccharomyces cerevisiae have been reported to bind or degrade aflatoxin.Here，detoxification of aflatoxin B1（AFB1）by wild－type strain ofS.cerevisiae（BY4742）and three mutants of anti－oxidative relating genes（zwf1Δ，sod2Δandglr1Δ）were determined by HPLC.In PBS buffer，AFB1binding abilities of viable and dead cells were 74%－76%and 71%－73%，respectively，indicating AFB1was removed by yeast cells mainly through cell adsorption.In YPD medium，clearance of AFB1by three mutant viable cells reduced，while that by wildtype BY4742 remaining high.AFB1binding ability ofglr1Δdecreased most seriously，then was that ofsod2Δandzwf1Δ.Thus，the deletion of critical anti－oxidative relating genes would decrease the AFB1binding ability ofS.cerevisiaegrowing cells.

aflatoxin，Saccharomyces cerevisiae，anti－oxidative gene，detoxification

＊通信作者：李永富（1969－），男，江苏盱眙人，工学硕士，副教授，主要从事粮食资源的综合利用研究。E－mail：liyf＠jiangnan.edu.cn

TS 26

A

1673－1689（2012）05－0468－05

2011－06－17

国家自然科学基金项目（No.30870056）。

史锋（1970－），女，江苏丹阳人，工学博士，副教授，主要从事微生物化与分子生物学研究。E－mail：shifeng＠jiangnan.edu.cn