酱油发酵用2种米曲霉中性蛋白酶的酶学性质比较

王 栋， 冯 杰， 郑志永， 张丽敏， 詹晓北＊

（1.江南大学 生物工程学院，2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

酱油发酵用2种米曲霉中性蛋白酶的酶学性质比较

王 栋1，2， 冯 杰1，2， 郑志永1，2， 张丽敏1，2， 詹晓北＊1，2

（1.江南大学 生物工程学院，2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

米曲霉产蛋白酶的性质对酱油品质有重要的影响。研究以一株产中性蛋白酶的米曲霉CICIM F0899为研究对象，首先对其进行扫描电镜观察，与米曲霉沪酿3.042比较表明F0899的分生孢子头较小，分生孢子大于沪酿3.042。其次对F0899和沪酿3.042产蛋白酶酶学性质研究表明F0899产蛋白酶在20～40℃保持稳定，最适反应温度为60℃，在p H 6.0～8.0时保持稳定，最适反应p H为8.0，在盐浓度为18%的条件下，仍能保留20%的酶活，可达沪酿3.042的2.2倍，Ag＋对F0899有严重的抑制作用，Fe3＋没有明显的抑制。因此，米曲霉CICIM F0899产的蛋白酶在耐高温、耐低p H和耐高盐的性能优于沪酿3.042。

酱油发酵；大曲；蛋白酶；酶学性质，米曲霉

酱油是传统调味品，具有悠久的历史，由于其色泽红润香气浓郁，深受我国、日韩和东南亚各国人民的喜爱［1－4］。米曲霉是酱油酿造中最重要的微生物，菌丝生长迅速，成熟后呈现黄绿色，主要产生蛋白酶，还可以产生淀粉酶、糖化酶、纤维素酶等。其中，蛋白酶的作用最为重要，米曲霉所产生的蛋白酶产量、种类、活性和稳定性不仅会影响酱油的原料利用率，而且还会影响到酱油的氨基酸组成及风味。目前，在酱油的工业生产中普遍使用米曲霉沪酿3.042［5］。沪酿3.042是1976年由上海市酿造科学研究所通过紫外线诱变和长期驯化得到的优良菌株，具有蛋白酶活力高，分生孢子大，数量多，生长繁殖快，抗杂菌能力强，酿造的酱油风味较好和不产毒素等优点，基本可以满足酱油酿造的需要［6］。米曲霉CICIM F0899保存于江南大学工业微生物重点实验室，具有生长迅速，产香气浓郁和蛋白酶活力高等优点。酱油虽然起源于中国，但是目前在国际上的影响力却落后于日本，这与菌种和落后的发酵工艺有着密切的关系，因此，寻找优良的发酵菌株并探索出更优的工艺对酱油产品品质的提高具有重要意义，国内外对此都有较多的研究［7－8］。酱油酿造过程中，原料在各种酶系的作用下发生生物和生化反应的过程，通常分为两个阶段：大曲阶段和酱醪阶段。大曲阶段主要是让米曲霉生长并产生大量的酶，酱醪阶段则是原料在各种酶的作用下发生反应的过程［9－10］，蛋白酶的作用方式和作用条件最为关键，直接影响酱油品质和原料利用率，酱醪的生理环境具有高盐、低p H的特点，许多酶的活性和稳定性会受到不利影响［11］，不仅大大延长了发酵周期，而且还降低了原料利用率。因此，寻找一种可以产生耐盐蛋白酶的米曲霉，不仅可以提高原料利用率、缩短发酵周期，还能提高酱油品质，对酱油产业具有重要的意义。

本文用扫描电镜技术对米曲霉CICIM F0899和沪酿3.042进行了观察，并且同沪酿3.042蛋白酶的性质进行了比较，研究了温度、p H、盐度和金属离子对蛋白酶活力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米曲霉CICIM F0899（以下简称F0899）保存于江南大学工业微生物菌种保藏中心；米曲霉沪酿3.042保存于江南大学生化工程与生物反应器研究室；干酪素（化学纯）、福林酚、戊二醛、醋酸异戊酯、四氧化锇等（均为分析纯）上海生化试剂公司。

1.2 仪器与设备

3K15高速冷冻离心机：德国Sigma产品；MAPADA UV－1800分光光度计：上海美谱达产品；CPD－030临界点干燥仪：瑞士BAL－TEC公司产品；SCD－005离子溅射仪：瑞士BAL－TEC公司产品；QUANTA－200扫描电镜：荷兰FEI公司产品。

1.3 菌种活化培养

将保存的米曲霉菌种接种于PDA固体培养基中，置30℃培养48 h，活化后备用。

1.4 电子扫描电镜观察

将培养48 h的米曲霉，用刀片切取一小块，在体积分数5%的戊二醛中固定4 h，然后用0.1 mol／L的磷酸缓冲液漂洗数次，过夜4℃保存，直到将戊二醛洗净。再用质量分数1%四氧化锇固定，并用0.1 mol／L的磷酸缓冲液漂洗数次，4℃保存。洗净样品之后，分别用体积分数30%、50%、70%的乙醇梯度脱水，再加入无水乙醇脱水两次。室温下分别加入乙醇：醋酸异戊酯为2∶1的溶液2 m L，放置5 min，吸出原溶液，再加入乙醇：醋酸异戊酯为1∶2的溶液2 m L。5 min后吸出原溶液，加入纯的醋酸异戊酯，洗两遍。之后进行临界点干燥，离子溅射，最后用扫描电镜观察。

1.5 制曲方法

将豆粕、炒麦和拌料水按照质量比为：1.1∶0.9∶2混匀后，经过121℃，30 min灭菌处理。以质量分数1%接种量接入培养好的种曲，控制曲料品温在30℃，培养48 h，取样测定大曲蛋白酶酶活。

1.6 大曲蛋白酶提取方法

向取出的大曲曲样中加入1∶20（g∶m L）的0.1 mol／L，p H 值为7.2的Na2HPO4－Na H2PO4缓冲溶液，于40℃水浴中，间歇搅拌，浸提1 h，滤纸过滤得蛋白酶酶液。

1.7 蛋白酶活测定方法

采用改进的福林酚法［12］。大曲蛋白酶活定义为1 g干质量大曲中所含的蛋白酶在40℃，p H值7.2条件下每1 min水解干酪素产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位（U）。

1.8 蛋白酶产生过程曲线

将种曲接入配制好的大曲培养基中，置于30℃条件下静置培养，分别在12、18、24、30、36、42和48 h取样测定大曲的蛋白酶活，绘制蛋白酶活随时间的变化曲线。

1.9 温度对蛋白酶活性的影响

将酶液分别于20～70℃下反应，测定酶活，以温度为横坐标，最大酶活为100%，以残余酶活为纵坐标，绘制曲线。为测定蛋白酶的温度稳定性，将酶液置于20～70℃条件下处理30 min，再在最适条件下测定酶活，以最大酶活为100%，绘制曲线。

1.10 pH值对蛋白酶活性的影响

将酶液分别于p H 值3.0～10.0（p H 值3.0～5.0 用 Tris－HCl 缓 冲 液；p H 值 5.0～8.0 用Na2HPO4－Na H2PO4缓 冲 液；p H 值8.0～10.0用Tris－NaOH缓冲液）的条件下反应，测定酶活，以p H值为横坐标，最大酶活为100%，以残余酶活为纵坐标，绘制曲线。为考察蛋白酶的p H值稳定性，将酶液置于p H值3.0～10.0的缓冲液中，于25℃处理12 h，再在最适条件下测定酶活，以p H值为横坐标，最大酶活为100%，以残余酶活为纵坐标，绘制曲线。

1.11 NaCl对蛋白酶活性的影响

将酶液置于不同浓度的NaCl溶液中测定酶活，以盐度为横坐标，最大酶活为100%，以残余酶活为纵坐标，绘制曲线。将酶液放置于18 g／d L的NaCl溶液中，保存在4℃条件下，每两天测定一次酶活，观察蛋白酶在高盐条件下的稳定性，以天数为横坐标，最大酶活为100%，以残余酶活为纵坐标，绘制曲线。

1.12 金属离子对蛋白酶活性的影响

向酶液中加入 Ag NO3、AlCl3、CaCl2、CoCl2、CuSO4、Fe2（SO4）3、MgSO4，MnSO4和ZnSO4至终浓度为5 mmol／L，于25℃静置30 min，测定酶活，并以空白对照为100%，计算剩余酶活。

2 结果与分析

不同微生物的产酶特性存在着差异，往往可以通过细胞形态和酶学性质反映出来，以下通过扫描电镜观察的方法，考察了两株米曲霉之间的形态差异，并且比较了两者蛋白酶在温度、p H、盐度和金属离子方面的异同。

2.1 扫描电镜结果

为了研究F0899同沪酿3.042在微观形态上的差异，采用扫描电镜技术对二者进行了分析（见图1）。

图1 米曲霉沪酿3.042和F0899扫描电镜照片比较Fig.1 SEM images of Aspergillus oryzae 3.042 and F0899

从图1可以看出，F0899的分生孢子头呈放射形，直径44.9～53.1μm，比沪酿3.042的分生孢子头小，沪酿3.042的分生孢子头直径通常在43.5～67.8μm。两者的分生孢子都呈现近似椭圆形，表面粗糙，F0899的分生孢子明显大于沪酿3.042，长轴约为4.5～6.2μm，短轴约为3.6～5.2μm，而沪酿3.042的分生孢子长轴约为3.6～4.3μm，短轴约为3.1～4.0μm。

2.2 蛋白酶产生过程曲线

掌握米曲霉生长和产酶的过程可以为发酵过程控制提供依据。在接入种曲后，分别于12、18、24、30、36、42 h和48 h取样测定大曲的蛋白酶活，得到了大曲蛋白酶活随时间的变化曲线。

图2 米曲霉沪酿3.042和F0899大曲蛋白酶产生过程Fig.2 Protease production in koji of Aspergillu oryzae 3.042 and F0899

由图2可知，米曲霉沪酿3.042和F0899的蛋白酶产生都主要集中在18～30 h，蛋白酶活在36 h时达到最大，F0899的蛋白酶活力可达到1 933 U／g（干基），沪酿3.042的蛋白酶活力达到1887 U／g（干基），并且都随着培养时间的延长酶活缓慢下降，F0899的大曲蛋白酶活在18～24 h间迅速增加，明显超过了沪酿3.042的产酶速度，说明菌株F0899的生长和产酶速度明显优于沪酿3.042。

2.3 最适反应温度和酶的热稳定性

温度是酱醪发酵中重要的影响因素，通过影响蛋白酶的活性和稳定性进而影响到酱油的产率和品质，因此，了解蛋白酶的性质是采取合适工艺的基础。

图3 温度对蛋白酶活性和稳定性的影响（（a）最适反应温度 （b）热稳定性）Fig.3 Temperature effect to protease activity and stability（（a）optimum temperature（b）temperature stability）

由图3（a）可知，米曲霉沪酿3.042的蛋白酶活性随温度的升高而增加，在50℃达到最大值，当温度继续升高，蛋白酶开始加速失活，当温度达到70℃时，蛋白酶活力仅剩余80%。米曲霉F0899的蛋白酶活性也随温度的升高而增加，在60℃时达到最大值。还可以看出，米曲霉F0899的蛋白酶活力在低温时明显高于沪酿3.042，并且对高温有着更好的耐受性。邓靖研究了米曲霉M3的中性蛋白酶性质，发现该酶的最适反应温度为50℃，并且在40℃以下保持稳定［13］。

由图3（b）可知，米曲霉沪酿3.042和F0899的蛋白酶在低于40℃，保持30 min条件下具有良好的热稳定性，在50℃时，F0899蛋白酶的热稳定性明显高于沪酿3.042，当温度继续升高，蛋白酶则加速失活。米曲霉KFRI888的中性蛋白酶在50℃以上时稳定性明显下降［14］。汤鸣强对米曲霉F－81的中性蛋白酶进行了研究，发现在40℃以下时，酶的稳定性良好，在60℃处理20 min，酶几乎完全失活［15］。

2.4 最适反应p H和p H稳定性

p H值对酶活性和稳定性具有重要的影响，反应体系p H值的变化，会影响酶活性部位的基团解离状态，从而影响酶的活性。极端的p H值会使维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰，导致酶自身的变性。

图4 pH对蛋白酶活性和稳定性的影响（（a）最适反应p H（b）p H稳定性）Fig.4 pH effect to protease activity and stability（（a）optimum pH（b）p H stability）

由图4（a）可知，米曲霉沪酿3.042和F0899的蛋白酶最适反应p H值在6.0～8.0，酶活随p H值的下降而迅速下降，当p H值到达4.0时，酶活仅剩余20%左右。当p H到达10.0时，酶活仅剩余40%左右，两株菌的蛋白酶都属于中性蛋白酶。

由图4（b）可知，米曲霉沪酿3.042和F0899的蛋白酶在p H值为5.0～9.0的范围内保持稳定，随着p H值的下降，酶活的稳定性下降，当p H值达到3.0时，酶活仅剩余30%，还可以看出F0899的蛋白酶在p H值4.0时，稳定性明显高于沪酿3.042，剩余酶活可达到65%，而沪酿3.042仅为40%。

酶的作用依赖于合适的p H值环境，如酸性蛋白酶活性随着p H值升高而下降，中性蛋白酶发挥作用通常最好在中性或偏碱性条件下［16］。李艳丽发现米曲霉ZW－06的中性蛋白酶在p H值6.0～10.0的环境下都能保持较高的稳定性［17］。

2.5 NaCl浓度对蛋白酶活性的影响

高盐稀态酱醪发酵是将18～25 g／d L的盐水加入成曲后，进行发酵的过程，通常盐度保持在18 g／d L以上。高盐环境会使酶表面的带电荷情况发生改变，从而引起酶的构象变化，导致酶与底物的结合能力发生改变，最终影响到酶的催化性能。因此，在高盐环境下蛋白酶的活力受到严重抑制，影响了原料的降解速度和利用率，不仅延长发酵周期，而且降低酱油的品质。筛选获得高耐盐蛋白酶成为解决高盐发酵的关键，对酱油产业的发展具有重要的意义。

由图5（a）可知，沪酿3.042和F0899的蛋白酶活性随着盐度的升高而逐渐下降，这与许多学者的研究结果一致［16－19］。但是，当 NaCl浓度达到18 mg／d L时，沪酿3.042蛋白酶酶活仅剩余9%而F0899蛋白酶活性高达20%，为前者的2.2倍。F0899的蛋白酶活力在高盐条件下明显好于沪酿3.042，在酱油生产中将具有更加明显的优势。由图5（b）可以看出，NaCl浓度对蛋白酶活力的稳定性没有太大影响，到第14d时，沪酿3.042和F0899的蛋白酶活仍可保留70%和75%。

2.6 金属离子对蛋白酶活性的影响

金属离子会和酶的活性中心发生作用，进而影响酶的活力，实验考察了一些常见的金属离子对沪酿3.042和F0899的蛋白酶活力的影响。

图5 氯化钠对蛋白酶活性的影响（（a）最适反应盐度 （b）盐度稳定性）Fig.5 NaCl effect to protease activity（（a）optimum NaCl concentration（b）NaCl concentration stability）

图6 不同金属离子对蛋白酶活性的影响Fig .6 Metal ions effect to protease activity

从图6可以看出，Mn2＋和Cu2＋对蛋白酶有轻微的促进作用，Li＋、Ca2＋、Co2＋、Mg2＋、Zn2＋对蛋白酶也均有轻微的抑制作用，而Ag＋对沪酿3.042和F0899的蛋白酶都有严重的抑制作用，酶活仅能剩余24%和33%。Al3＋对蛋白酶也有较为明显的抑制作用，酶活剩余63%和43%。而Fe3＋对两者的抑制作用明显不同，对沪酿3.042的蛋白酶具有较强的抑制作用，酶活仅剩余44%，这与邓靖［13］、汤鸣强［15］所报道的米曲霉中性蛋白酶受到Fe3＋的强烈抑制相一致。对F0899的蛋白酶几乎没有明显的抑制，酶活可剩余89%。

3 结语

本实验对一株可以产生耐高盐蛋白酶的米曲霉菌株CICIM F0899进行了研究，并和在生产中广泛应用的米曲霉沪酿3.042进行了比较。得到以下结论：

（1）米曲霉F0899的分生孢子头较小，而分生孢子明显大于沪酿3.042；

（2）米曲霉F0899及沪酿3.042产蛋白酶主要集中在18～30 h，而且蛋白酶的分泌速度明显高于沪酿3.042；均在40℃以下保持稳定，最适反应温度分别为50℃和60℃；在p H值6.0～8.0保持稳定，最适反应p H值分别为8.0和7.0；

（3）米曲霉F0899及沪酿3.042的蛋白酶活性随着盐浓度的增加而下降，米曲霉F0899蛋白酶的耐盐性明显高于3.042，在18 g／d L NaCl浓度下酶活仍保留20%，而3.042仅剩余9%；

（4）Ag＋对米曲霉F0899及沪酿3.042的蛋白酶都有严重的抑制作用，Fe3＋对两者的抑制作用明显不同，对F0899的蛋白酶几乎没有明显的抑制，酶活可达到89%，对3.042的蛋白酶具有较强的抑制作用，酶活仅剩余44%。

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Characteristic Comparison of Two Neutral Proteases Used for Soy Sauce Fermentation

WANG Dong1，2，FENG Jie1，2，ZHENG Zhi－yong1，2，ZHANG Li－min1，2，ZHAN Xiao－bei＊1，2

（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Wuxi 214122，China）

The characterization of protease from Aspergillus oryzae has a significant impact on soy sauce quality.In this study，an Aspergillus oryzae CICIM F0899 capable of producing neutral protease was investigated.Morphology of Aspergillus oryzae F0899 and Aspergillus oryzae 3.042 were imaged by SEM.The conidial head of Aspergillus oryzae F0899 was relatively smaller than that of the strain 3.042.Its conidia were larger than that of the 3.042 strain.In addition，properties of the protease secreted by this strain were tested and compared with profiles of an industrially strain Aspergillus oryzae 3.042.The results showed that the optimum temperature for the extracellular protease from F0899 was 60℃，with the stable temperature range between 20～40℃.The optimal pH was 8.0，with the stable pH range between 6.0～8.0.It could tolerate 18%sodium chloride and still retains 20%activity，which is as high as 2.2 times than that from 3.042 under the same condition.The activity of the enzyme was severely inhibited by Ag＋，but affected by Fe3＋only slightly.Therefore，protease from Aspergillus oryzae F0899 can bear higher temperature，lower pH and higher NaCl concentration than that from 3.042.

soy sauce production，koji，protease，enzymatic properties，Aspergillus oryzae

＊

詹晓北（1962－），男，北京人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事发酵工学与生化工程研究。E－mail：xbzhan＠yahoo.com

Q 819

A

1673－1689（2012）05－0479－07

2011－06－16

国家“十一五”科技支撑计划项目（2008BAI63B06，2007BAK36B03），国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAD23B04）.

王栋（1982－），男，河南三门峡人，博士研究生，主要从事发酵工程学研究。