耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化的研究

尹红英 王红兵

基因的突变、缺失是抑癌基因失活的主要途径，近年来研究表明启动子区域CpG岛的甲基化是导致抑癌基因失活的又一重要途径[1]。乳腺癌易感基因 ( breast cancer susceptibility gene,BRCA1)是参与多种肿瘤发生的抑癌基因[2]，研究表明其参与细胞周期调控、DNA损伤修复、基因的转录调节、细胞凋亡和泛素化等重要的细胞活动[3]。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术，检测耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株BRCA1基因启动子CpG岛甲基化的状态，以探讨A549/Taxol细胞对紫杉醇的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

细胞基因组DNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司；BRCA1基因甲基化检测试剂盒为GENMED公司产品；PCR试剂盒为 Promega公司产品；引物由上海生物工程技术有限公司合成；耐紫杉醇人肺腺癌 A549细胞株(A549/Taxol)购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 A549/Taxol细胞培养 取A549/Taxol细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃含5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 甲基化特异性PCR(MSP) 取对数期生长的A549/Taxol细胞，参照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，在UV 3 000紫外分光光度仪上测定吸光度值鉴定DNA纯度，OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间。取2 μg基因组DNA，参照BRCA1基因甲基化检测试剂盒说明书进行甲基化修饰。分别取修饰DNA及未修饰DNA 100 ng进行MSP反应。BRCA1基因甲基化引物：M，F：5′- TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3′，R：5′- AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3′。非甲基化引物：U,F：5′- TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3′，R：5′-CAAAAAATCTCAACAAAC-TCACACCA-3′。反应体系按照PCR试剂盒推荐量25 μl体系进行：PCR混合液12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板1 μl，无核酶水9.5 μl。MSP循环条件：95 ℃预变性12 min，95 ℃变性40 s，甲基化引物60℃退火45 s，非甲基化引物在57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，循环扩增35次，72℃ 10 min。应用Gene Amp PCR System 2400扩增仪(美国PE公司)。甲基化特异性引物(M)扩增的目的片段为75 bp，非甲基化特异性引物(U)扩增的目的片段为86 bp。取10 μl PCR产物在2.5﹪琼脂糖凝胶上电泳，以TIANGEN 50 bp DNA Ladder(MD108-01)为标准DNA Marker同步电泳，紫外灯下观察，凝胶成像系统记录并分析。判断标准[4]：M阳性、U阴性为完全甲基化；M阳性、U阳性为部分甲基化；M 阴性、U阳性为非甲基化。

2 结果

MSP结果显示，耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞(A549/Taxol)中BRCA1基因呈部分甲基化，见图1。

图1 BRCA1基因甲基化检测(MSP) M为甲基化(75 bp)，U为非甲基化(86 bp)

3 讨论

肺癌严重威胁人类生命与健康，其发病隐匿，进展迅速，约2/3患者确诊时已失去手术机会，化疗是综合治疗中的主要措施之一。紫杉醇由太平洋紫杉属短叶紫杉中提取，它通过促进微管聚合、抑制微管解聚影响细胞的有丝分裂，进而发挥其细胞毒作用。该药因其显著的抗癌作用而被用于肺癌化疗的一线用药，但因易产生耐药，在很大程度上影响了其长期疗效。

BRCA1基因自 1994年被成功定位分离后，国内外学者对其进行了广泛而深入的研究，BRCA1基因定位在17q21，是抑癌基因，阻滞细胞周期于G/M期。目前已知BRCA1基因是重要的功能基因[5]，参与细胞周期调控、基因转录调节、抑制细胞生长、DNA损伤修复。BRCA1基因还具有促进肿瘤细胞凋亡，抑制转移和血管生成的作用。引起BRCA1基因表达缺失的机制主要有突变和 DNA甲基化。BRCA1基因突变与家族性乳腺癌及卵巢癌的发生密切相关，BRCA1基因启动子甲基化主要发生在散发性乳腺癌和卵巢癌[6]。目前BRCA1基因甲基化的研究主要集中在乳腺癌及卵巢癌，在肺癌方面报道甚少。耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株BRCA1基因甲基化的相关基础研究目前尚无报道。

近年来，人们逐渐认识到肿瘤是在环境因素的作用下通过遗传学和表观遗传学的改变而发生的，包括癌基因的活化和抑癌基因的失活。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码 RNA等。DNA甲基化是表观遗传学中研究最多的基因调控方式。抑癌基因启动子甲基化可抑制基因表达而使其功能丧失，在肿瘤发生和发展中起重要作用。与遗传学改变不同，表观遗传学改变在一定条件下可以逆转，这一特性为疾病的治疗提供新的机遇，也成为近年的研究热点[7]。本实验应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术，检测耐紫杉醇人肺腺癌 A549细胞BRCA1基因启动子甲基化状态，结果A549/Taxol细胞BRCA1基因启动子CpG岛区域存在甲基化，呈部分甲基化，为下一步研究提供依据。

[1] Deaton AM,Bird A.CpG islands and the regulation of transcription〔J〕.Genes Dev,2011,25(10):1010.

[2] Hong H,Yen HY,Brockmeyer A,et al.Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and s sporadic ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2010,70 (1):221.

[3] Morris JR,Boutell C,Keppler M,et al.The SUMO modification path-way is involved in the BRCA1 response to genotoxic stress〔J〕.Nature,2009,462 (7275):886.

[4] 王红兵,王亚丽,刘德生,等.尿多酸肽对人肺腺癌A549细胞的作用及人肺腺癌A549细胞株E-cadherin基因甲基化的研究〔J〕.实用癌症杂志,2010,25(5):445.

[5] Antill YC,Mitchell G,Johnson SA,et al.Gene methylation in breast ductalfluid from BRCA1and BRCA2 mutation carriers〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19 (1):265.

[6] Kleer CG.Carcinoma of the breast with medullary-like features:diagnostic challenges and relationship with BRCA1 and EZH2 functions〔J〕.Arch Pathol Lab Med,2009,133 (11):1822.

[7] Cai FF,Kohler C,Zhang B,et al.Epigenetic therapy for breast cancer〔J〕.Int J Mol Sci,2011,12(7):4465.