HER2基因在胃癌组织中的表达及其临床意义

刘姗姗 彭忠异 文亦磊 崔锦珠 王进声 张锡流

近年来研究表明，细胞生长和增殖信号的过度刺激及细胞凋亡的抑制等可以打破细胞增殖生长和死亡清除之间的平衡，进而可以引起肿瘤的发生。内皮生长因子受体2(HER-2)是1种磷酸化受体蛋白,其在肿瘤中的过度表达,最终影响肿瘤细胞的增殖、分化和浸润转移。目前，有关HER-2在胃癌组织中表达的研究报道甚少，有关应用荧光原位杂交(FISH技术)结合传统HE染色及免疫组化(IHC技术)检测胃癌标本HER-2扩增及HER-2表达情况的报道更是罕见。我们应用FISH技术及IHC技术，检测HER-2扩增及HER-2基因表达情况；探讨HER-2基因表达、扩增与胃癌生物学行为的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集广西中医药大学第一附属医院病理科2009年～2011年存档的胃癌活检标本20例。胃癌患者中，男性13例，女性7例；年龄35～78岁，中位年龄62岁。按WHO国际组织分类标准：管状腺癌(高、中分化型)12例，低分化型腺癌6例，未分化型腺癌2例。按国际抗癌联盟(UICC)临床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期8例;侵及浆膜层11例，未侵及浆膜层9例；伴有淋巴结转移7例。胃癌患者活检前均未接受过放化疗及其它针对肿瘤的治疗。

1.2 试剂与方法

GLP HER2/CSP 17探针、HER-2 FISH TM检测试剂盒购自北京金菩嘉生物技术有限公司；即用型C-erbB-2兔抗人单克隆抗体、免疫组化Envision plus广谱试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

FISH检测方法：采用金菩嘉HER2 DNA FISH探针(标记红色荧光)，设对照探针(标记绿色荧光),其中主要含DNA FISH探针和杂交缓冲液。标本处理：①石蜡切片于65℃烤片过夜，常规脱蜡至水， 50℃下用30%酸性亚硫酸钠处理组织切片20～30 min。2×SSC溶液中漂洗5 min×2次。②37℃蛋白酶K工作液中孵育20～30 min，然后在2×SSC溶液中漂洗5 min×2次，0.1M HCl中室温浸泡5～10 min，再次在2×SSC溶液中漂洗5 min×2次。③脱水：玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各脱水2 min，再室温浸入丙酮溶液中2 min，自然干燥玻片。FISH技术：①变性：73℃±1℃的70%甲酰胺变性液中浸泡5 min，然后依次置于预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中进行梯度脱水各3 min。②杂交：10 μl探针混合液滴于玻片组织上,盖上盖玻片,橡皮胶封片。73℃变性5 min,42℃杂交过夜。③洗涤：在73℃的2×SSC/0.3% NP40洗脱液中洗涤2 min,再于室温洗涤5 s,自然干燥。观察结果：暗处自然干燥玻片，将15 μl DAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20 min后，荧光显微镜下观察。

免疫组化法(Envision二步法)：石蜡切片于65℃烤片2 h，常规脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗3 min×3次。pH6.0柠檬酸盐缓冲液微波加热修复10 min，PBS冲洗3 min×2次。阻断内源性过氧化物酶的活性：3% H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次。滴加一抗，室温孵育2 h。PBS冲洗5 min×3次。滴加聚合物增强剂试剂A，室温孵育20 min。PBS冲洗3 min×3次。滴加酶标抗鼠/兔聚合物试剂B，室温孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次。滴加DAB液，显微镜下观察5 min。苏木精复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

1.3 结果判断

IHC技术检测HER2蛋白表达结果判定[1]：无染色或<10%的细胞胞膜染色为“-”，>10%的细胞不完整胞膜染色为“+”，>10%的细胞有较弱的完整胞膜染色为“++”，>10%的细胞有较强的完整胞膜染色为“+++”。“-”和“+”视为无或低表达，“++”和“+++”视为过表达。FISH技术检测HER2基因扩增结果判定[2]：正常细胞红色信号/绿色信号为2∶2；异常细胞红色信号>2且绿色信号≥2。计数30个细胞，统计Ratio值(Ratio值=同30个细胞核中红/绿)。Ratio<1.8为“-”，无扩增；Ratio>2.2为“+”，扩增；Ratio在1.8～2.2之间时，增加计数细胞至100个加以判断。

1.4 统计学处理

数据应用SPSS13.0统计学软件处理，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

IHC检测20例胃癌组织中HER-2蛋白阳性表达6例，阳性率为30%；FISH检测HER-2基因扩增7例，扩增率为35%。胃癌组织中HER-2/neu蛋白阳性表达及HER-2/neu基因扩增，均与患者性别、年龄和肿瘤分化程度无显著相关性(P>0.05)，而与肿瘤浸润深度、TNM分期及淋巴结转移显著相关(P<0.05)，结果见表1、2。

表1 HER2蛋白表达与胃癌临床病理参数的关系(例，%)

3 讨论

3.1 HER2的检测方法及技术

目前美国食品及药物管理局( FDA)批准用于HER2检测的方法有2种:即免疫组化法(IHC)和荧光原位杂交法(FISH)[3]。IHC法是检测H ER2基因蛋白水平较常用的1种方法，它能对HER2癌基因进行定位,阳性者的细胞膜上出现棕黄色颗粒；FISH法为检测HER2基因扩增的1种方法,用于检查分裂期细胞的核型、识别染色体数目,确定肿瘤细胞的来源[4]。

表2 HER2基因扩增与胃癌临床病理参数的关系(例，%)

IHC和FISH具有需要组织少，可保持原有组织结构并做形态学检测的优点，这既满足了对不同区域癌组织的研究需要，又避免了样本中非肿瘤成分的影响，在技术上IHC和FISH完全可完全标准化和自动化。由于IHC实验修复过程影响蛋白质表达，因此对于HER2蛋白表达的研究,IHC无法避免假阳性。FISH检测HER2基因的扩增时，DNA的稳定性比蛋白质强,实验操作影响较小,且其结果定量判读,尽量避免了主观上的误差。故本实验综合采用IHC和FISH 2种检测方法。据文献报道，在HER2高表达的乳腺癌标本中，IHC与检测基因水平的FISH全面符合率达96%[5]。在本研究中，胃癌HER2的表达检测IHC与FISH全面符合率达95% ，与上述结果基本一致。

3.2 HER2与肿瘤发生发展的关系

原癌基因HER2又称c-ebrB-2，属于表皮生长因子受体家族，定位于人染色体17q21，编码1种分子量为185 kD的跨膜蛋白，在正常情况下处于非激活状态[6]。HER2受体胞内区有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸残基Tyr磷酸化位点。特异性生长因子与HER2受体结合后可诱导二聚体化并激发受体的交叉磷酸化，磷酸化的受体可以把细胞外的生长信号迅速转导至核内，刺激控制与细胞分裂有关的基因表达。HER2基因可通过基因突变被激活，且其扩增将导致转录上调，蛋白合成增加，从而参与抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖，上调血管内皮生长因子VEGF/血管通透性因子VPF，促进肿瘤新生血管生成，增强肿瘤细胞侵袭力，破坏机体抗侵袭屏障等[7]。HER2癌基因扩增的产物可以通过不同的信号传导通路，最终导致细胞无序增殖和恶性转化，HER2蛋白过表达在细胞的分裂、增殖、转化、促进肿瘤的转移、侵袭、黏附中也发挥重要作用[8]。HER2基因扩增和(或)蛋白过表达往往提示肿瘤恶性程度高，转移能力强。

3.3 HER2表达与胃癌临床病理参数的关系

目前，有文献报道在结直肠癌中，HER2基因的扩增、突变与HER2蛋白表达有关[9]。HER2基因扩增和蛋白过表达广泛存在于乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、食管癌、结肠癌和肺癌等恶性肿瘤中[10]。已经证实20%～40%乳腺癌中存在HER2基因的扩增及过度表达，并认为HER2基因表达是乳腺癌独立的预后因素[11]。本研究结果显示，在20例胃癌组织中HER2基因扩增率为35%，HER2蛋白表达率为30%，HER2基因扩增和蛋白表达与患者性别、年龄无关，说明胃癌中HER2表达无性别、年龄差异；在不同分化程度的胃癌中，HER2蛋白阳性率及基因扩增率亦无显著性差异，揭示了HER2表达与胃癌细胞分化程度无显著相关性;而侵及浆膜层胃癌中HER2阳性表达率及基因扩增率显著高于未侵及浆膜层者，提示HER2表达的胃癌组织局部侵袭性更大;伴有淋巴结转移的胃癌HER2阳性表达率及基因扩增率高于未发生淋巴结转移者，这表明HER2参与了胃癌的淋巴转移过程；HER2阳性表达率及基因扩增率胃癌Ⅲ期和Ⅳ期中高于Ⅰ期和Ⅱ期，证明随着肿瘤浸润、转移能力增强，HER2基因表达也增强，从而进一步促进了肿瘤浸润及转移，加速了病情的进展。总之，HER2在胃癌向中晚期发展、向深部组织浸润、发生淋巴结转移的过程中起着非常重要的作用。

3.4 HER2检测的临床价值与意义

近来，能特异性针对肿瘤靶点，从分子水平阻断肿瘤恶性生物学行为，抑制肿瘤细胞生长的分子靶向治疗MTT已经成为肿瘤研究的热点[12]。HER2靶向抗体曲妥珠单抗(herceptin,赫赛汀)是1种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部位，通过抑制HER-2 蛋白表达而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的,适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌[13]。NCCN临床治疗指南己将Herceptin列为中高风险早期乳腺癌患者辅助治疗及转移性乳腺癌治疗的基本用药。对于Herceptin在胃癌上的使用因为HER2在胃癌的表达实验结果不一，故其在胃癌上的使用经验不多。Tanner 等[14]报道HER2靶向抗体对有HER2基因扩增的胃癌和乳腺癌细胞N87和SKBP-3都一样有抑制生长作用，Rebischunge等[15]证实HER2靶向抗体联合化疗对HER2基因过度表达的转移性胃癌有效。本研究结果表明，在胃癌中HER2蛋白有较高的阳性表达率、HER2基因有较高的基因扩增率，这就为Herceptin在胃癌的治疗提供了理论依据。

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