发酵法生产还原型谷胱甘肽的研究进展

董 坤，朱希强，王凤山

(1.山东大学 药学院生化与生物技术药物研究所，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院，山东 济南 250101)

发酵法生产还原型谷胱甘肽的研究进展

董 坤1，朱希强2，王凤山1

(1.山东大学 药学院生化与生物技术药物研究所，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院，山东 济南 250101)

谷胱甘肽是一种含有巯基的活性三肽化合物，已广泛应用于医药、食品和化妆品行业中。此文从发酵、分子水平和分离纯化三个方面综述了微生物发酵法生产谷胱甘肽的研究概况，并对发酵法生产谷胱甘肽的发展前景进行了展望，旨在为谷胱甘肽在发酵生产方面的研究提供参考。

谷胱甘肽;发酵;分离纯化;研究进展

谷胱甘肽(glutathione，GSH)又名 γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的生物活性三肽化合物，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中［1］。GSH的存在形式主要有两种，即还原型谷胱甘肽(reduced glutathione)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)，其中，大约90%以上以还原型谷胱甘肽的形式存在。由于GSH在抗氧化、免疫、解毒等方面有着重要生理功能［2］，目前已广泛应用于临床、食品和化妆品行业中。

GSH的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法等。化学合成法是以三种前体氨基酸为原料进行化学合成，但因为所得活性产物不易分离致使产品纯度不高而限制了其应用。酶法合成是利用三种底物氨基酸和生物体内的与GSH合成有关的酶，通过添加少量ATP(三磷酸腺苷)来合成GSH，该法操作复杂且成本较高。发酵法可以利用廉价的生产原料，通过特定的微生物代谢合成GSH，操作简单，成本较低，且生产速率快，易于扩大规模。因此，发酵法生产GSH越来越受到人们的重视。

1 GSH的生物合成途径

GSH的生物合成由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通过r-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)催化合成［3］。其中，GSHⅠ是GSH合成中的限速酶，受GSH的反馈抑制。在合成过程中，每合成一分子的GSH需要消耗二分子的ATP。另外，GSH也可以在NADPH(还原型辅酶Ⅱ)存在时通过GSH还原酶将GSSG还原得到。GSH的生物合成途径如图1所示。

图1 GSH的生物合成过程

2 发酵研究

在微生物界，GSH产生菌主要集中在真核酵母和革兰阴性菌中。野生型酿酒酵母和产朊假丝酵母本身具有较高的GSH含量(占细胞干重的0.1% ～1.0%)并且能够持续保持GSH的合成能力，因此它们已成为工业生产GSH最常用的菌种 在发酵生产中 产量的提高通过两个途径来实现:一是提高菌体本身细胞内GSH的含量;二是提高菌体生物量使GSH的总量提高。

2.1 菌种选育

野生型酿酒酵母和产朊假丝酵母本身具有较高的GSH合成能力，但其产量只适用于实验室研究，无法满足工业生产。通过物理诱变或化学诱变，在特定的培养基上筛选GSH高产菌株是提高菌种产量 性能的主要手段 常用的物理或化学诱变剂主要有:紫外线、X-射线、γ-射线、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍(NTG)等，而特定培养基上的筛选物质主要有L-乙硫氨酸、DL-乙硫氨酸、甲硫氨酸、1，2，4-三氮唑等。通过这种传统的菌种诱变和筛选方式，得到了一系列GSH高产菌株。表1列举了目前国内外通过诱变选育得到的GSH高产菌。

表1 GSH高产菌的国内外诱变选育情况

2.2 培养基组成和发酵条件的优化

对培养基组成的优化主要包括碳源、氮源、无机盐等的优化，而对发酵条件的优化主要是对温度、pH、溶氧以及接种量等的优化。在传统的培养基组成和发酵条件的优化中主要采用单因素优化，这种方法工作量大，费时、费力。若运用一些实验设计方法(如正交实验设计、中心复合实验设计［11］、均匀设计［12］等)和数据处理方法(如响应面分析［10］、神经网络模型［13］等)不但减少了工作量，提高了实验效率，而且实验结果具有更高的可信度和实际应用价值。Zhang等［12］利用均匀设计对发酵培养基的主要成分进行了优化，优化后GSH的产量比优化前提高了1.81倍。Shao等［10］首先通过Plackett-Burman设计从众多影响因素中筛选得到影响GSH和S-腺苷甲硫胺酸(SAM)产量的显著因素，然后通过Box-Behnken设计得到GSH和SAM的最佳发酵培养基组成方案，此方法的成功应用，使得GSH和SAM的总产量提高了2.4倍。苄芙蓉等［14］应用Plackett-Burman设计和球面对称设计实验对酵母发酵生产GSH的培养基进行优化，通过优化实验，发酵液中谷胱甘肽积累量比优化前产量提高约56.2%。同样，对发酵条件的优化也可以采用实验设计的方法。Santos等［15］利用析因设计和中心复合实验设计研究了温度、转速、溶氧和葡萄糖浓度对Saccharomyces cerevisiae生产GSH的影响，并发现优化后GSH产量提高接近4倍。

2.3 发酵过程的控制

GSH的发酵过程可以分为细胞生长和GSH合成两个阶段，所以，GSH总量的增加可以分别在这两个阶段通过增加细胞的生物量或者细胞内GSH的合成量来实现，而对发酵过程的控制可以同时从这两个方面使GSH的总量提高。通过补料分批培养实现高密度发酵是增加细胞生物量的最成熟和最完善的方法。但是在实际发酵过程中，由于溶氧、副产物积累等因素影响了细胞的生长，从而难以实现高密度发酵。所以，在利用酵母发酵生产GSH的过程中，通常采用流加补料的方式来延长细胞对数生长期和稳定期，从而得到高浓度的菌体密度。GSH的合成与发酵液中葡萄糖的浓度密切相关，如果葡萄糖浓度超过一定值时会发生Crabtree效应，从而抑制细胞的生长，因此发酵过程中葡萄糖的供给模式非常重要。陈坚等［16］比较了恒速流加、人工反馈控制流加和指数流加3种补糖策略对重组大肠杆菌高密度发酵合成GSH的影响，发现指数流加的方式最为理想，认为指数流加在提高菌体浓度、生产强度和GSH总量方面具有显著优势。

2.4 前体氨基酸和ATP的添加

GSH的生物合成需要谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸等前体氨基酸，所以在GSH发酵过程中添加适量的前体氨基酸可以有效地增加GSH在细胞内的积累。研究表明，L-半胱氨酸是GSH产量提高的关键氨基酸，但过量的半胱氨酸会对细胞生长产生抑制作用［17］。所以，在GSH发酵过程中如何优化三种前体氨基酸的添加方式，使前体氨基酸能促进GSH的合成但不会对细胞的生长产生抑制作用是至关重要的。尹良鸿等［18］研究了利用产朊假丝酵母生产GSH的氨基酸添加策略，发现在3 L发酵罐中发酵36 h时流加葡萄糖的同时添加20 mmol/L L-胱氨酸，45 h时添加混合氨基酸(L-谷氨酸40 mmo/L，L-半胱氨酸40 mmol/L，甘氨酸60 mmol/L)，最终GSH产量达1 725.3 mg/L，比高密度培养提高了111.4%。然而，在前体氨基酸添加过程中，由于半胱氨酸极易被氧化，大部分半胱氨酸在被细胞利用之前已被氧化为胱氨酸，降低了半胱氨酸的利用率。针对这一点，Liang等［19］研究了溶氧水平对半胱氨酸利用率的影响，发现在添加半胱氨酸后的3 h内溶氧控制在5%，之后的12 h将溶氧控制在20%，可减少半胱氨酸添加量，使GSH产量提高13%。

GSH在细胞内合成是一个耗能过程，所以在发酵过程中添加适量的ATP可以在一定程度上提高GSH的合成。Liang等［20］研究了在产朊假丝酵母发酵过程中，在添加前体氨基酸的基础上添加ATP发现GSH产量达到2 043 mg/L，较对照高出11%，证明了ATP对GSH的合成有提高作用。但是直接添加ATP不仅价格昂贵，而且反应产生的ADP(二磷酸腺苷 对 Ⅰ的活性产生抑制作用 所以构建高效经济的ATP再生系统对提高GSH的产量和降低生产成本有重要的意义。Lin等［21］利用重组 E.coli add/ade(pBV03)和S.cerevisiae WSH2构建了一个生物合成GSH的种间耦合系统，降低了耦合系统中从腺苷到次黄嘌呤的不可逆转化，保证了耦合系统中ATP再生的效率。最终证明，该耦合系统GSH的合成量达到10.08 mmol/L，为对照组的4.03倍。

2.5 胁迫剂的添加

Riccillo等［22］的研究阐述了GSH对于保护细胞在外界胁迫作用下和极端环境下生存具有重要作用。利用微生物细胞的这种生理应答特性，人为地添加氧化剂和提高发酵液渗透压都对酵母细胞起到刺激作用，而酵母细胞可利用自身的应激反应能力，合成更多的GSH以抵御不良环境的刺激［23］。Liang等［24］利用 GSH 可以抵御 H2O2产生的自由基这一特性，考察了不同时间不同浓度H2O2胁迫对产朊假丝酵母合成GSH的影响，发现利用H2O2的连续胁迫可使GSH的产量提高54.6%。

在发酵液中添加ATP可以提高GSH的合成效率。但是，有研究表明由于细胞膜本身通透性的限制，只有21%的ATP能够进入细胞被利用［25］。因此，采取适当的措施改变细胞膜的通透性既可以提高ATP的利用效率，又可以将GSH释放到细胞外从而解除GSH的过量积累对GSHⅠ的反馈抑制。Nie等［26］在利用产朊假丝酵母高密度发酵生产GSH的基础上，考察了低pH胁迫对GSH合成的影响，结果表明，在发酵24 h后将pH由5.5降至1.2并维持6 h，细胞内的GSH几乎全部释放到细胞外，GSH的最终产量提高了24.9% 。除此之外，添加 NaCl［27］、表面活性剂(如 SDS［28］、吐温80［29］)等可改变细胞膜通透性的方法也都提高了GSH的产量。

3 分子水平研究

在GSH的生物合成过程中天然的GSH合成酶系活力都较低，利用基因工程技术，通过对编码E.coli中GSHⅠ和GSHⅡ的基因进行克隆重组来提高其活力，并分别在E.coli和酵母菌中进行高效表达，可提高GSH的合成能力［30］。Liao等［31］通过在大肠杆菌中表达2个拷贝数的GSHⅠ和1个拷贝数的GSHⅡ来提高GSH合成酶系的活力，结果表明GSH的产量达到34.8 mg/g(细胞湿重)，是目前所报道的在E.coli中表达产量最高的。Fei等［32］利用毕赤酵母表达效率高、易实现高密度培养等优点，将酿酒酵母的GSHⅠ和GSHⅡ的基因融合GAP强启动子在毕赤酵母中表达，发现重组菌GSH的产量达到217 mg/L，通过在5 L发酵罐上进行补料分批培养和前体氨基酸添加，最终GSH的产量达到4.15 g/L。

4 分离纯化研究

GSH是胞内产物，需要从细胞内将GSH提取出来，提取的主要方法有细胞破碎法和抽提法。由于细胞破碎法在GSH释放出来的同时也将蛋白质、氨基酸、核酸等释放出来，从而不利于后续的分离纯化。抽提法是通过物理或化学方法改变细胞壁的通透性使GSH释放出来的方法，较为常用。周迪楠等 考察了分别利用热水抽提 甲酸抽提 乙醇抽提、硫酸抽提、三氯乙酸抽提、有机酸抽提、低温抽提等方法从酵母中抽提GSH的效果，发现利用热水抽提法的效率高、耗时短、经济且无污染。王晓菊等［34］通过正交试验优化了热水抽提法的抽提条件，并在此基础上加入一定量的高氯酸，使GSH的抽提率和回收率进一步提高。另外，乙醇抽提法凭借其价廉、简便且有效的特点也受到关注。Xiong等［35］使用乙醇抽提法提取酿酒酵母中的GSH，通过全因子析因设计(FFD)优化了乙醇浓度、提取时间和提取温度，结果表明乙醇的浓度对抽提效率有很大影响，并且乙醇抽提法不破坏细胞的完整性，简便了后期纯化，有利于工业化生产。

目前报道的GSH的分离纯化方法主要有4种:(1)铜盐法。该法具有工业使用价值，但因产生大量的H2S气体而逐渐被淘汰;(2)离子交换树脂法。由于其高经济效益，该法已被越来越多的研究者使用，如王淼等［36］采用两步阳离子交换树脂法，通过第一步离子交换除去部分杂质，第二步离子交换集中纯化，最终酵母提取液中GSH的回收率大于70%，纯化倍数大于100倍;(3)双水相法。该法是利用GSH在双水相中的不同分配，达到与发酵液中其它杂质分离的目的，具有简便、能耗低、易于规模化及能保持生物活性的特点。Wu等［37］采用PEG/葡聚糖和PEG/盐的双水相系统从离心除菌后的发酵液中萃取 GSH，GSH的总萃取率达83.55%。但双水相系统的成本较高，还只适用于实验室研究;(4)亲和色谱法。Zhao等［38］报道了利用固定化金属离子亲和层析提纯GSH的方法，依据巯基化合物与Zn2+有很强的亲和作用，将Zn2+固定到硫脲树脂上制成含锌硫脲树脂，用于提纯酵母提取液中的GSH，最终GSH的回收率达到91.22%且避免了重金属污染。

5 展望

近年来，GSH在医药、食品等工业中的应用越来越广。虽然目前国内微生物发酵法生产GSH的研究逐渐增多，但是大部分还只是在实验室阶段，工业化生产的技术还不够成熟，GSH的供应仍然主要依赖日本等发达国家进口。因此，要提高GSH的发酵水平，还需加大工业化技术的研究强度，可从几方面开展工作:(1)通过常规诱变育种筛选到更优良的GSH高产、稳定的菌株，并根据GSH的合成和代谢途径，进行发酵条件的优化，通过建立动力学模型对生产进行评估;(2)在GSH分批发酵过程中，存在溶氧不足、底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻碍等问题，不适合工业化的生产，应在补料分批发酵或连续发酵方面进行深入的研究;(3)加强GSH生物合成的分子生物学研究，并指导GSH高产菌种的基因工程和代谢工程改良;(4)建立高效的产品分离、纯化回收工艺，获得具有自主知识产权的GSH生产技术。

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Research advances of glutathione production by fermentation

DONG Kun1，ZHU Xi-qiang2，WANG Feng-shan1
(1.Institute of Biochemical and Biotechnological Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

TQ464.7

A

1005-1678(2012)04-0511-04

2011-09-22

董 坤，男，硕士研究生，微生物与生化药学专业，E-mail:don_king@163.com;王凤山，通信作者，教授，博士生导师，E-mail:fswang@sdu.edu.cn。