胸腺五肽脂质体的处方及制备工艺研究

张 冕 ，罗 磊，万 芳

(荆楚理工学院 化工与药学院，湖北 荆门 448000)

胸腺五肽脂质体的处方及制备工艺研究

张 冕 ，罗 磊，万 芳

(荆楚理工学院 化工与药学院，湖北 荆门 448000)

目的 研究胸腺五肽脂质体的处方筛选及制备工艺。方法 采用逆向蒸发法制备胸腺五肽脂质体，超速离心法测其包封率，以包封率和粒径为指标，采用正交试验设计法优化处方，并对其表面特征、包封率、粒径等情况进行考察。结果 最佳处方制备的胸腺五肽脂质体平均粒径为108.2 nm，药物的平均包封率为62.10%，Zeta电位为－48 mV，脂质体外观圆整均匀，分散性好。结论 所制胸腺五肽脂质体工艺简单、重现性好，粒径小，包封率较高，为其进一步研究奠定了基础。

胸腺五肽;脂质体;制备工艺;正交设计

胸腺五肽(thymopentin，Tp5)是天然胸腺生成素(thymopoietin，TP)Ⅱ第32～36位的氨基酸序列片段，由以下5个氨基酸构成:精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸，它保留了胸腺生成素的免疫活性中心，具有与TP相似的生物活性，是一种双向免疫调节剂，临床上广泛用于类风湿性关节炎、恶性肿瘤、慢性肝炎及严重感染等疾病的治疗，有广阔的发展前景［1］。由于Tp5在胃肠道内稳定性差，易被蛋白酶和氨肽酶降解为氨基酸，半衰期约为30 s，对胃肠道黏膜的穿透性差，故常规的给药途径仍是注射，但需频繁注射给药，患者依从性差，而口服通常难以吸收或生物利用度极低。

为此，本研究选取逆向蒸发法将Tp5制成脂质体口服给药，以提高药物的稳定性和生物利用度。通过正交实验对处方及制备工艺进行了优化，以改善其粒径大小、提高其包封率，为开发Tp5脂质体新剂型提供了一定的实验依据。

1 材料

Tp5(杭州中肽生化有限公司，批号:091019，含量97.16%);Tp5对照品(上海信然生物技术有限公司，批号:140728，含量99.17%);胆固醇(上海政翔化学制剂研究所，批号:08322);大豆磷脂(广州市海圣生物科技有限公司，批号:081220);维生素E(Sigma公司，批号:59-02-9);甲醇为色谱纯;其余试剂均为分析纯。

RE-501旋转蒸发仪(河南巩义予华仪器有限公司);漩涡振荡器(郑州南北仪器设备有限公司);TEM-100CXⅡ透射电镜(日本电子公司);Zetasizer3000HS激光粒度分析仪(英国Malvern公司);Agilent1100高效液相仪(美国Agilent公司)。

2 方法与结果

2.1 Tp5脂质体的制备

采用逆向蒸发法［2］。精密称取处方量的大豆磷脂、胆固醇、维生素E至茄形瓶中，加入乙醚使其溶解，再加入Tp5磷酸盐缓冲溶液，冰浴条件下超声5 min，形成均匀乳剂，于20℃旋转蒸发去除乙醚至凝胶形成，再上漩涡振荡器，凝胶崩溃转成液体，继续在旋转蒸发器上干燥，进一步除去残留有机溶剂，最后充氮气至醚味消失，密封保存于冰箱中。

2.2 Tp5的HPLC测定色谱条件

色谱柱:ZORBA ×SB －C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流动相:磷酸盐缓冲液(pH 7.0)-甲醇(60∶40);流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL;紫外检测波长:275 nm;灵敏度:0.01AUFS。

2.3 标准曲线的制备

取Tp5对照品约25 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。精密吸取适量，用水分别稀释成质量浓度为 10.0，50.0，100.0，200.0，400.0μg/mL的溶液，照2.2项下的条件测定，记录色谱图，以质量浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程:A=10 775 C+9 601，r=0.999 9，可见 Tp5 在 10.0 ～400.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.4 Tp5脂质体包封率的测定

取样品20μL，用水稀释50倍，在4℃，13 000 r/min离心30 min。取上清液，HPLC法测定游离药物Tp5浓度(Cf)。加入20%TritonX-100溶解沉淀，HPLC法测定包入脂质体的Tp5浓度(CL)。计算Tp5 的包封率［3-4］，包封率 =CL/(CL+Cf) ×100%。

2.5 Tp5脂质体的处方优化

通过单因素考察及文献资料［5-6］确定了超声时间、超声功率、缓冲溶液的pH值、水浴温度、水化时间等，在此基础上选取对脂质体性质影响较大的4个主要因素进行处方优化，每个因素选取3个水平，以包封率和粒径为指标，采用正交设计进行进一步的优化，因素水平见表1，正交设计结果见表2。

由表1～2可见，各因素的影响大小为A＞D＞B＞C，最佳组合为A3B2C1D3，即脂质体的最佳处方为大豆磷脂:胆固醇为4∶1，药物:大豆磷脂为1∶10，维生素 E:胆固醇为 1∶8，有机相:水相为 3∶1。

2.6 处方验证

对优化处方进行3次验证试验，包封率分别为62.11%，61.42% 和 62.76%，平均值为 62.10%，RSD为1.10%。实验结果表明，按最佳处方制备的三组脂质体包封率较为接近，重现性较好，可知该处方和工艺稳定可行。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

表9 正交试验结果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal test

2.7 形态观察与粒度分析

取最优处方制备的脂质体混悬液适量，用水稀释一定的倍数，用2%磷钨酸负染后滴加到专用铜网上，自然挥干，使粒子浓缩沉积，置于透射电子显微镜下观察，见图1。由图1可见，脂质体表面光滑圆整，球形均匀度较好。测得最优处方中脂质体的平均粒径为(108.2±11.7)nm，粒径分布为20～120 nm，多分散系数为0.28，Zeta电位为－48 mV。

图1 脂质体透射电镜观察(×29 000)Fig.1 Observation under the transmission electron microscope of liposomes(×29 000)

3 讨论

由于多肽类药物口服易受酶降解，因此有必要将肽类药物制备成适宜的剂型才能口服，而脂质体口服制剂即是一种很有发展前途的给药系统。

Tp5有较好的水溶性，脂质体的制备方法较多，其中逆向蒸发法对水溶性物质具有较高的包封率。本实验以大豆磷脂、胆固醇为膜材，采用逆向蒸发法制备Tp5脂质体，操作简便可靠，重现性好，无需特殊的仪器设备。对于微粒体给药，一般认为粒径越小其生理活性越高［7］，该工艺制备的脂质体粒径较小，较目前文献报道的方法有独特的优势。

预试验结果表明，大豆磷脂和胆固醇能较快溶于乙醚，所以选择乙醚作为有机溶剂。逆向蒸发法制备过程中脂质和药物需要超声，而超声可使某些物质变性，因此对超声的时间和功率进行了预试验，最后确定超声功率为500 W，超声时间为5 min。

测定包封率的方法有凝胶柱色谱法、超滤法和渗析法等，预试验表明超速离心法效果较好，重复性好，故采用超速离心法测定Tp5脂质体的包封率。研究发现处方中加入适量抗氧剂维生素E后，有效的抑制或减慢了脂质体中磷脂的氧化反应，因此脂质体的包封率有明显的提高。此外，pH值对脂质体亦有一定的影响。磷脂成分均在pH为6.5时最稳定，结合Tp5的理化性质，通过预试验最终在制备过程中采用pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液，在该pH，Tp5脂质体较稳定。

本研究制备的Tp5肽脂质体工艺简单、重现性好、包封率高、粒径较小，Zeta电位表明体系具有较好的物理稳定性。体内稳定性及有关体内外的药理药效学研究正在进行中。

［1］袁晓佳，张志荣，何 勤.胸腺五肽三甲基壳聚糖纳米粒包封率的测定［J］.华西药学杂志，2005，20(2):131-133.

［2］朱盛山.药物新剂型［M］.北京:化学工业出版社，2004:430-431.

［3］程晓丹，李学明，顾 立.脂质体对水溶性药物包封方法的研究进展［J］.华西药学杂志，2009，24(2):194-197.

［4］李可欣，陈大为，商捷等.脂质体中蛋白类药物包封率的测定［J］.沈阳药科大学学报，2010，27(9):680-685.

［5］尹 佳，张亚兰，莫 毅，等.CA4P脂质体的制备工艺研究［J］.华西药学杂志，2009，24(6):594-596.

［6］程建峰，扈本荃，刘 梅，等.甘草酸脂质体的处方及制备工艺［J］.第四军医大学学报，2006，27(7):655-657.

［7］郑爱萍，王奎书，郝 睿，等.胸腺五肽pH-敏感壳聚糖纳米粒的制备、体外释放及生物活性［J］，中国药学杂志，2007，42(9):679-685.

Study on formulation and preparation of thymopentin liposome

ZHANG Mian，LUO Lei，WAN Fang
(School of Chemical Engineering and Pharmacy，Jingchu University of Science and Technology，Jingmen 448000，China)

Purpose To study the optimal formulation and preparation of thymopentin liposome.Methods Reverse-phase evaporation technique was chosen for the preparation of thymopentin liposome and entrapment efficiency was measured by ultracentrifugation.Orthogonal design was used to optimize the formulation by taking encapsulation efficiency and the particle size as indexes.The properties of liposome including morphology，entrapment efficiency，mean diameter，etc were studied.Results Mean diameter and encapsulation efficiency of the prepared thymopentin liposome were 108.2 nm and 62.10%，respectively.The Zeta-potential was －48 mV.The liposome was smooth and spherieal in appearance with better dispersion.Conclusion Preparation technique is simple and reproducible.The thymopentin liposome prepared in this study has smaller size and higher encapsulation efficiency.It was worthy to be further studied.

thymopentin;liposome;preparation process;orthogonal test

R944.9

A

1005-1678(2012)04-0427-03

2011-07-18

湖北省荆门市科技局引导计划项目(2007YDS37)

张 冕，女，硕士，讲师，研究方向:药物新剂型与制剂新技术，E-mail:mian416@163.com。