舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP的部分理化性质测定

黄立峰，俞昌喜

(1.南京军区福州总医院 药学科，福建 福州 350025;2.福建医科大学 药学院，福建 福州 350004)

舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP的部分理化性质测定

黄立峰1，俞昌喜2

(1.南京军区福州总医院 药学科，福建 福州 350025;2.福建医科大学 药学院，福建 福州 350004)

目的 对舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP成分进行纯化及部分理化性质测定。方法 采用色谱技术纯化蛇毒MP成分，质谱仪测定其相对分子质量(Mr);Edman降解法分析部分氨基酸序列，与已知成分比对;以卵磷脂为底物测定MP组分的磷脂酶A2活性;采用Bliss法测定MP对小鼠的急性毒性。结果 MP的Mr为13 260，其N端16位氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSR，与已知蛇毒磷脂酶A2基本一致，并具有较强的磷脂酶A2活性;腹腔注射MP对小鼠的LD50值为14.3 mg/kg。结论 MP为一种眼镜蛇毒磷脂酶A2。

眼镜蛇毒;毒蕈碱样多肽;磷脂酶A2;理化性质

非洲绿唇曼巴蛇(Dendroaspis angusticeps)毒液中含有一种能选择性激动M1胆碱受体的MTs(muscarinic toxins)成分，被证明能显著改善动物学习记忆障碍，具有开发为神经退行性病变治疗新药的潜力［1］。随后 Miyoshi等［2-3］从曼巴蛇以外蛇种毒液中分离到类似MTs作用的蛇毒磷脂酶A2成分MIs(muscarinic inhibitors)，其理化性质与MTs差别较大。本课题前期从我国舟山眼镜蛇毒液中也分离到一种能与M胆碱受体高度亲和，并能激动豚鼠回肠M胆碱受体的成分，作用类似MTs及MIs，暂命为毒蕈碱样多肽(muscarinic peptide，MP)［4］。为明确MP性质及进行深入研究的需要，本文对MP进行纯化，并测定其相关理化性质。

1 材料

MP 成分系本课题组前期通过色谱柱色谱法从舟山眼镜蛇(Naja atra)毒液中分离获得［4］;卵磷脂购自上海试剂总厂。

Poros® CM 4.6/100离子交换色谱柱，美国Applied Biosystems公司;SOURCE®5RPC ST4.6/100色谱柱，美国Amersham Biosciences公司;Finnigan LCQ Deca XP MAX离子阱质谱仪，Thermo Electron Corporation;Procise 491HT氨基酸测序仪，Applied Biosystems公司。

雄性昆明种小鼠，体质量18～22 g，福建医科大学实验动物中心提供，合格证号:闽实动质准第002-04号。

2 方法与结果

2.1 柱色谱纯化

2.1.1 离子交换色谱 采用线性梯度洗脱法，在Poros® CM 4.6/100预装柱上纯化MP成分。上样液(A 液)为 pH 4.6，0.02 mol/L 醋酸铵缓冲液;洗脱液(B液)为含0.8 mol/L氯化钠的A液。测定A280，绘制洗脱曲线，见图1。收集主峰组分，浓缩脱盐。采用SDS-PAGE(Tris-甘氨酸系统)碱性不连续电泳，银染法鉴定蛇毒蛋白组分的纯度。

电泳(浓缩胶为5%，分离胶为15%)结果表明，经Poros® CM 4.6/100预装柱纯化的MP组分呈单一蛋白条带，达到纯化目的，见图2。

图1 MP组分的Poros® CM 4.6/100离子交换色谱图Fig.1 Ion-exchange chromatography of fraction MP on Poros®CM 4.6/100 perfusion chromatography column

图2 眼镜蛇粗毒及其各色谱分离的活性组分的SDS-PAGE图Fig.2 SDS-PAGE of the crude venom and the active fractions on each chromatography

2.1.2 反相色谱 采用 SOURCE® 5RPC ST 4.6/100反相色谱柱，以线性梯度洗脱法纯化蛇毒MP成分。上样液(A液)为 1 mol/L醋酸铵溶液(pH 7.0)-乙腈-水(1∶2∶97);洗脱液(B 液)为 70% 乙腈溶液，检测波长为280 nm。洗脱色谱显示单一对称主峰(图3)，收集主峰组分作为质谱分析和氨基酸序列测定的MP样品。

图3 MP的SOURCE® 5RPC ST 4.6/100反相色谱图Fig.3 Elution profile of MP from SOURCE® 5RPC ST 4.6/100 chromatography column

2.2 质谱分析

采用Finnigan LCQ Deca XPMAX对MP进行质谱分析，测得MP的相对分子质量(Mr)为13 260(图4)。MP的Mr与眼镜蛇南洋亚种(Naja naja sputatrix)毒液中的 MI(Mr约13.6 kD)［2］接近，而与曼巴 蛇(Dendroaspis angusticeps) 毒 液 中 的 MTs［5］(Mr约7 kD)及眼镜蛇孟加拉亚种(Naja kaouthia)MTLPs［6］(Mr约 7 kD)相差较大(表 1)。

图4 MP的质谱图Fig.4 Mass spectrum of MP

2.3 N端氨基酸序列测定

根据Edman降解法，采用Procise 491HT测定MP组分的 N端 16位氨基酸序列，结果为NLYQFKNMIQCTVPSR (Asn-Leu-Tyr-Gln-Phe-Lys-Asn-Met-Ile-Gln-Cys-Thr-Val-Pro-Ser-Arg)。MP的 N端16位氨基酸序列与MI几乎一致，并与其他眼镜蛇毒磷脂酶 A2的序列基本一致［2］，而与 MTs［5］和MTLPs［6］完全不同，提示MP与 MI及其他眼镜蛇毒磷脂酶A2具有较大的同源性，而与MTs和MTLPs关系不大(表1)。

2.4 磷脂酶A2活性测定

参照文献［8］，以卵磷脂为底物测定MP组分的磷脂酶A2活性。在搅拌下，对照管依次加入底物缓冲液(3.75 mmol/L 卵磷脂、0.1 mol/L 甘氨酸、3.57 mmol/L硼酸、6.03 mmol/L去氧胆酸钠，调 pH至8.50)8.0 mL、150 mmol/L EDTA 溶液 0.1 mL、受试品0.4mL;测定管依次加入底物缓冲液8.0 mL、0.5 mol/L氯化钙溶液0.2 mL、受试品0.4 mL。两管均于37℃ 水浴60 min，之后对照管加入0.5 mol/L氯化钙溶液0.2 mL;测定管加入150 mmol/L EDTA溶液0.1 mL结束反应。用5 mmol/L盐酸滴定液将对照管的pH值滴定至测定管的pH值，以所消耗的盐酸计算测定管中酶的活力(37℃下，将每分钟每毫克样本反应消耗盐酸1μmol定义为一个磷脂酶A2活性单位)。

经测定，纯化MP组分的磷脂酶A2活性为242 U/mg，相当于原蛇毒的2.3倍。

表1 MP以及眼镜蛇磷脂酶A2的N端部分氨基酸序列Tab.1 N-terminal amino acid Sequences of Naja atra muscarinic protein and phospholipase A2 from genus Naja

2.5 小鼠急性毒性试验

取禁食不禁水12 h的小鼠56只，按体质量随机分成7组，腹腔注射不同浓度的蛇毒蛋白组分(0.1 mL/10 g体重)。设计各组动物给予的MP组分剂量为8，10，12.4，15.5，19.3，24 和 30 mg/kg 体重。根据72 h内动物的死亡情况，采用Bliss法计算 LD50值为 14.3 mg/kg。

3 讨论

从MP的Mr、N端氨基酸序列以及其磷脂酶A2活性看，认为MP是一种类似MI生物活性的蛇毒磷脂酶 A2。

自从1988年 Adem 等［9］首次从 D.angusticeps蛇毒中分离得到两种能与M胆碱受体高度亲和毒素(MT1和MT2)以来，人们陆续在其它蛇种的蛇毒中发现了类似的蛇毒成分［1］。根据这些蛇毒成分的理化性质，大致可分为两类:一类是以D.angusticeps蛇毒中发现的MTs为代表的蛇毒蛋白［7］。同类的蛇毒成分还有从N.koauthia蛇毒中分离的MTLPs(muscarinic toxin-like proteins)［6］。这类蛇毒蛋白的空间结构与蛇毒突触后神经毒素的所谓“三指蛋白”［10］(具有三个多肽结构域，酷似三个手指而得名)结构相似，几乎具有相同的氨基酸数目(63～66个氨基酸)，Mr约为7 000。另一类是Miyoshi和Tu分别从 N.naja sputatrix 蛇毒分离的 MIs［2-3］，与前一类不同的是，这类蛇毒蛋白具有磷脂酶A2的活性。

根据理化性质分析，本研究从舟山眼镜蛇蛇毒中分离的MP可归入上述第二类蛇毒蛋白。首先，从Mr看，MP为13.3 kD 非常接近 N.naja sputatrix蛇毒中的 MI［2］(13.6 kD)，明显大于 MTs［5］( ～ 7 kD)和 MTLPs［6］( ～7 kD);其次，MP 的 N 端氨基酸序列与眼镜蛇科蛇毒磷脂酶A2的N端氨基酸序列高度同源，这一点与 MI极其相似;再次，与 MIs［2］相同的是MP也具有磷脂酶A2的酶活性，而MTs和MTLPs均不具有此酶活性。

胆碱能神经系统调控许多重要生理功能，在生物体内发挥着关键的作用。蛇毒中有很多成分都能影响该系统功能，如突触后神经毒素可抑制运动终板N型胆碱受体而产生神经毒作用，很早就被用于N胆碱受体的研究［11-12］。而蛇毒成分对M胆碱受体的作用研究只在近年才兴起［9］。曼巴蛇毒中的MTs能与M胆碱受体高度亲和，某些MTs能激动外周和中枢组织的M胆碱受体引起相应的效应［7］，产生类似M1胆碱受体激动剂MCN-A-343和CPCP(4-［N(4-chlorophenyl)carbamoyloxy］-4-pent-2-ynyl-trimethyl-ammonium iodide)的作用，注入大鼠脑内海马部位可显著改善动物学习记忆障碍［13］。本研究的 MP 成分［4］与 Naja naja sputatrix 蛇毒的 MIs［2］对大鼠大脑组织M胆碱受体同样具有高度亲和力，且亲和力远强于MTs［5］，但它们在理化性质上与MTs有着明显差别。目前MIs对M胆碱受体的药理作用尚未见文献报道，而本研究已在离体标本上观察到MP激动豚鼠回肠M胆碱受体的作用，其具体机制有待进一步研究［4］。

［1］Jerusalinsky D，Kornisiuk E，Alfaro P，et al.Muscarinic toxins:novel pharmacological tools for the muscarinic cholinergic system［J］.Toxicon，2000，38(6):747-761.

［2］Miyoshi S，Tu T A.Phospholipase A2from Naja naja sputatrix venom is a muscarinic acetylcholine receptor inhibitor［J］.Arch Biochem Biophys，1996，328(1):17-25.

［3］Miyoshi S，Tu TA.A snake venominhibitor tomuscarinic acetylcholine receptor)mAChR):isolation and interaction with cloned human mAChR［J］.Arch Biochem Biophys，2000，377(2):290-295.

［4］郑佳冰，黄立峰，许 盈，等.舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应［J］.福建医科大学学报，2007，41(1):1-4.

［5］Jolkkonen M，Van Giersbergen L P，Hellman U，et al.Muscarinic toxins from the black mamba Dendroaspis polylepis［J］.Eur J Biochem，1995，234(2):579-585.

［6］Kukhtina V V，Weise C，Muranova A T，et al.Muscarinic toxin-like proteins from cobra venom［J］.Eur J Biochem，2000，267(23):6784-6789.

［7］Bradley K N.Muscarinic toxins from the green mamba［J］.Pharmacol Ther，2000，85(2):87-109.

［8］陈思锋，吴中立.体液和组织磷脂酶A2简便快速测定法［J］.第二军医大学学报，1989，10(3):254-256.

［9］Adem A，Asblom A，Johansson G，et al.Toxins from the venom of the green mamba Dendroaspis angusticeps that inhibit the binding of quinuclidinyl benzilate to muscarinic acetylcholine receptors［J］.Biochim Biophys Acta，1988，968(3):340-345.

［10］ Fruchart G C，Mourier G，Marquer C，et al.How three-finger-fold toxins interact with various cholinergic receptors［J］.JMol Neurosci，2006，30(1-2):7-8.

［11］ Tu T A.Neurotoxins from snake venom［J］.Chimia，1998(52):56-62.

［12］黄立峰，许云禄.福建产眼镜王蛇毒神经毒素的分离及活性测定［J］.福建医科大学学报，2004，38(2):125-128.

［13］ Jerusalinsky D，Kornisiuk E，Bernabeu R，et al.Muscarinic toxins from the venom of Dendroaspis snakes with agonist-like actions［J］.Toxicon，1995，33(4):389-397.

Biochemical characterization of the muscarinic peptide isolated from Naja atra venom

HUANG Li-feng1，YU Chang-xi2
(1.Department of Pharmacy，Fuzhou General Hospital of Nanjing Command，Fuzhou 350025，China;2.School of Pharmacy，Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China)

Purpose To identify the property of the fraction of muscarinic peptide(MP)isolated from Naja atra venom by purifying and determining the biochemical charaterization.Methods MPwas purified by column chromatography.Its molecular weight was determined by mass spectrometry.The partial amino acid sequence of MP was gained by Edman degradation analysis.Lecithin as substrate was used to measure phospholipase A2activity of MP.Bliss method was used to determine the acute toxicity of MPin mice.Results The molecular weight of MP was 13 260 D and its N-terminal 16 amino acid sequence was NLYQFKNMIQCTVPSR，which is consistent with the known venom phospholipase A2.MPalso displayed a strong phospholipase A2activity.The LD50value was 14.3 mg/kg in mice by intraperitoneal injection of MP.Conclusion It is suggested that MP is a snake venom phospholipase A2.

cobra venom;muscarinic peptide;phospholipase A2;biochemical characterization

R284;R285.5;R282.74

A

1005-1678(2012)06-0725-03

2012-04-28

福建省青年科技人才创新项目资助(2008F3084)

黄立峰，男，博士，主管药师，Tel:0591-22859783，E-mail:huanglifeng@yeah.net。