生物信息资源在耻垢分枝杆菌EmbB多克隆抗体制备中的应用

张文利，马 莉，辛 毅，徐跃飞，任 风，马郁芳，2

(1.大连医科大学，2.辽宁省糖生物学与糖生物工程重点实验室，辽宁 大连 116044)

生物信息资源在耻垢分枝杆菌EmbB多克隆抗体制备中的应用

张文利1，马 莉1，辛 毅1，徐跃飞1，任 风1，马郁芳1，2

(1.大连医科大学，2.辽宁省糖生物学与糖生物工程重点实验室，辽宁 大连 116044)

目的 建立通过生物信息学手段制备耻垢分枝杆菌(M.smegamatis)EmbB(Sm EmbB)多克隆抗体的方法。方法 应用生物信息资源在Sm EmbB的N端寻找一段18个氨基酸的特异短肽，合成后将其与白喉类毒素分子相连，以所形成的复合物免疫动物制备抗Sm EmbB的多克隆抗体。结果 Western blot结果显示获得的抗体可特异地作用于Sm EmbB。结论 通过生物信息学手段制备多克隆抗体方法的建立解决了对蛋白质功能研究中缺乏抗体的困扰，为特殊蛋白质的抗体制备提供了借鉴。

耻垢分枝杆菌;EmbB;生物信息;多克隆抗体

细胞壁是分枝杆菌所特有的结构，对细菌的生命、形态、毒性传播等非常重要。分枝杆菌细胞壁中具有两种主要成分［1-2］，即 mAGP(mycolic acid-arabinogalactan-petidoglycan)和LAM(lipoarabinomannan)。mAGP是由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖三种成分组成，是细胞壁的核心成分，直接影响了细胞壁的完整性。LAM为分枝杆菌细胞壁中另一种主要成分，主要由与细胞质膜相连的肌醇脂、甘露聚糖和阿拉伯聚糖三种成分组成，它与细菌的生命形态没有直接相关性，但与细菌导致的免疫应答及毒性传播等有关。阿拉伯聚糖是细胞壁中两种主要成分中共有的重要组成成分，在维持细胞壁的完整性及毒性方面起着重要作用。阿拉伯聚糖的生物合成是由多种糖基转移酶参与完成的，目前已知有五种糖基转移酶，即 EmbA、EmbB、EmbC、AftA和Rv1805，参与了分枝杆菌细胞壁中阿拉伯聚糖的生物合成［3-6］。其中EmbB和EmbA共同负责聚阿拉伯糖末端分支的合成［6-7］，具体功能与机制正在研究中。此外，EmbB也和抗结核药物乙胺丁醇的耐药菌株产生有关，资料表明EmbB基因的突变可导致抗乙胺丁醇耐药菌株产生［8-10］。

EmbB在保持细菌细胞壁完整性、免疫以及抗结核药物耐受性方面的影响，使其研究意义日益凸显。但是，目前从蛋白质水平对其研究甚少，一方面是由于市场上尚无针对分枝杆菌EmbB的特异性抗体出售;另一方面，由于EmbB为膜蛋白，且分子质量大，表达很困难，迄今为止没有表达并纯化的Em-bB蛋白产生，因而也不能通过表达纯化的蛋白免疫动物而获得其相应的抗体。抗体的缺乏限制了对它的研究，目前只能借助一系列的化学分析手段，分析蛋白质缺失后对聚阿拉伯糖结构变化的影响。然而由于聚糖结构非常复杂和相似，现有的分析手段对它的分析也是有限的。基于此，本文以耻垢分枝杆菌(M.smegamatis，Sm)的 EmbB(Sm EmbB)作为研究对象，采用一种新的方法去获得Sm EmbB的抗体:即应用生物信息学的方法，在Sm EmbB上寻找一段特异的约20个氨基酸的短肽，将其与一个大的免疫源片断连接，进而以此免疫复合物免疫动物而获得抗Sm EmbB的多克隆抗体。

1 材料

琼脂糖和LB培养基(Invitrogen/GIBCO公司);卡那霉素和潮霉素(Sigma公司);预染的蛋白质分子质量标准(Fermentas公司);硝酸纤维素膜(Pall公司);偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG抗体(北京中衫金桥生物技术有限公司);5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、氮蓝四唑盐酸盐(NBT)(Roche公司)。

高速低温离心机和超速低温离心机(美国贝克曼公司);JY92-Ⅱ型超声波细胞破碎机(宁波海曙科生仪器厂);JM-250型电泳仪、MV-Ⅱ型垂直板电泳槽、ST-2型半干式转移电泳仪(大连竞迈生物科技有限公司)。

清洁级8～12周龄雌性非孕 Balb/C小鼠，大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2008-0002。

2 方法

2.1 预测 EmbB 蛋白

从专业的微生物基因组数据库(TIGR)中获取Sm EmbB序列信息，利用各种生物信息学资源对Sm EmbB进行预测，包括二级结构及模序预测、跨膜情况分析、序列的相似性比对分析，从而确定候选的短肽序列，计算候选肽段的疏水性参数，在整个基因组中进行相似性分析，并最终确定该短肽。短肽的合理设计与正确的选择对于制备有效而特异的Sm EmbB抗体是非常关键的。

2.2 短肽复合物的合成及抗血清的获取

将已选择的短肽进行人工合成，并通过桥接分子马来酸咪唑葵酰基-N-羟琥珀酰亚胺与大分子化合物白喉类毒素相连接形成可用于免疫动物的大分子复合物;选用生长状态良好的8～12周龄雌性非孕Balb/C小鼠，用含有人工合成短肽的大分子复合物对小鼠进行免疫注射，共免疫3次，每隔2周再加强免疫注射1次，1周后采用摘眼球法采集血液，将抗血清在－20℃冰箱保存。

取血后，分离血清并用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗血清的滴度，以合成的含有Sm EmbB N端约20个氨基酸的短肽复合物包被ELISA板过夜，洗涤后加入获得的抗血清孵育2 h，洗涤之后加入碱性磷酸酶偶联的抗小鼠 IgG抗体进行孵育，之后以4-硝基苯磷酸二钠显色并测定其在405 nm波长处的吸光度值。

2.3 抗血清特异性鉴定

2.3.1 菌株及其生长条件 实验过程中所用到的embA基因敲除(ΔembA)、embB基因敲除(ΔembB)和embC基因敲除(ΔembC)的Sm菌株(M.smegmatis mc2155)均生长在含有25μg/mL那霉素的LB液体或固体培养基中，37℃培养。携带表达有野生型Sm embB基因及具有点突变的Sm embB基因的embB基因敲除的Sm菌株则生长在含有25μg/m卡那霉素和50μg/mL潮霉素的LB液体或固体培养基中，37℃培养。野生型Sm则生长在不含有任何抗生素的LB液体或固体培养基中，37℃培养。

2.3.2 膜蛋白的提取及 Western Blot鉴定 生长并收获至对数生长后期的上述相应的Sm菌液2 L，用超声方法破碎细菌(工作60 s，间歇90 s，10个循环)后，4℃，15 000 r/min离心1 h收集上清;在4℃，55 000 r/min离心上清 2 h，沉淀即为细胞膜蛋白;用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，取膜蛋白样品50μg进行10% ～20%梯度SDS-PAGE电泳，电泳完毕后进行转膜，应用免疫小鼠获得的抗血清进行免疫印记显色。以含有引入了野生型embB基因及其embB点突变的Sm以及野生型的Sm，embA、embB、embC基因敲除的Sm以及野生型Sm为样品，对免疫血清的特异性进行检测。

3 结果与讨论

3.1 对EmbB蛋白的预测

从 TIGR 基因组数据库(http://cmr.jcvi.org/cgi-bin/CMR/CmrHomePage.cgi)中获取 Sm EmbB蛋白序列，它是由1 093个氨基酸组成，分子质量为117.978 kD。对所获得的EmbB氨基酸序列进行下面的分析:① 膜蛋白情况分析。首先将此序列在SOSUI等网站上对其进行跨膜分析，如图1所示，Sm EmbB为跨膜蛋白，有13个跨膜区，根据图1的序列信息将跨膜区标出，如图2所示被方框所框的斜体灰色部分所示。膜蛋白的跨膜结构域多由一些疏水性的氨基酸组成，故这些结构域的部分不能作为短肽的候选部分;② 相似性分析。对Sm EmbB序列分析表明，它与另外两种阿拉伯糖基转移酶Sm EmbA和Sm EmbC同源性很高，因而分别从TIGR上获取Sm EmbA和Sm EmbC的氨基酸序列，并将这三种基因间进行相似性比对分析，将大约20个氨基酸且序列相似性低的部分标出(图2中下划线部分);③计算疏水性参数。计算被选中的短肽中的氨基酸疏水性参数，选取其中极性大的肽段作为候选;④BLAST分析。将候选肽段在TIGR中对所有基因组进行相似性比对分析，选取其中没有与其它基因组具有相似性或相似性很低的肽段。通过一系列的分析、预测，位于Sm EmbB氨基端、背景为灰色加重表示的18个氨基酸的肽段“SGEDAGKLQRTGYPDPNL”被选择(如图2所示)，送该肽段序列到生物公司进行化学合成和拼接。

图1 SOSUI网站对EmbB膜蛋白的预测Fig.1 The prediction of EmbB by SOSUI

图2 Sm EmbB跨膜结构分析以及可能的短肽候选序列Fig.2 The analysis on trans-membrane region and possible peptide candidates of Sm EmbB

3.2 Western blot方法鉴定多克隆抗体

应用合成的短肽复合物免疫小鼠，获得血清;应用ELISA方法测定抗血清的抗体滴度，选用1∶2 000的稀释抗体进行后续的抗体特异性验证。

本研究中设计并合成的小分子短肽，由于分子质量小，不足以激起机体的免疫应答，因而将其与一个大分子的白喉类毒素相拼接，借助于白喉类毒素的免疫应答作用而产生相应的抗体。由于白喉类毒素的分子质量很大，为避免短肽结构的抗原决定簇被白喉类毒素覆盖，本研究中应用了马来酸咪唑葵酰基-N-羟琥珀酰亚胺作为桥接的“分子臂”而将两段肽段连接，希望目的短肽能随着白喉类毒素的免疫应答作用而能产生相应的目的抗体。上述ELISA检测确认有相应的抗血清产生，但产生的抗血清是否能特异地作用于Sm EmbB，仍需进一步的证实。本研究中应用Western blot方法对其进行确认。

提取各种相关Sm的膜蛋白，用10% ～20%SDS-PAGE梯度胶进行电泳，电泳完毕后将其从SDS-PAGE胶转移到硝酸纤维素膜上，用获得的血清作为抗体对膜进行孵育，之后用偶联有碱性磷酸酶的抗鼠IgG孵育，并用NBT/BCIP显色。结果如图3所示。从图3中可知，野生型的Sm在约120 kD附近都有一条较弱的的条带产生，与预期的Sm EmbB蛋白的大小(117.978 kD)一致，这是来自于基因组上Sm EmbB蛋白的表达;而此120 kD处的条带在embB基因敲除的菌株内不能被检测出，这与预期的结果一致，同时也说明本研究室所获得的embB基因敲除的菌株内Sm EmbB确已不存在;当在embB基因敲除的耻垢分枝杆菌中引入功能性或点突变的Sm的embB基因，由于表达载体上强启动子的驱动(上述的基因均构建在pVV16载体上，这些基因的表达均受到pVV16上强启动子-Phs60的驱动，可产生过表达的基因产物)，使Sm EmbB蛋白过表达，其表达量明显多于细菌体内的自然状态，故在120 kD附近都有明显的条带产生;但从图3结果中可见，除了在120 kD附近的条带之外，在小分子的位置也有其它条带被检出，但条带的强度较弱，这是由于由小鼠抗血清得到的抗体为多克隆抗体(霍乱类毒素也能产生其相应的抗体)，因而也能与其它的蛋白质呈现色反应，但是从Western blot的结果可知，在120 kD附近的条带强度随着自然状态的Sm EmbB或过表达的Sm EmbB的有无而表现出有无或强弱，故可说明该抗体能特异地作用于Sm EmbB。因此，尽管有非特异条带的存在，仍不影响对该抗体能够特异性作用于Sm EmbB蛋白的认定。通过Western blot方法的检测，可确认通过用生物信息资源获得的Sm EmbB短肽，通过与大分子的霍乱类毒素连接后，能够免疫动物而获得能作用于Sm EmbB的多克隆抗体，并可将此抗体用于对Sm EmbB蛋白的研究。

图3 应用 Western blot对EmbB多克隆抗体的鉴定(膜蛋白样品均来自于相应的Sm)Fig.3 Identification of EmbB polycolonal antibody by Western blot analysis(Lane 1-6 are membrane proteins from M.smegmatis)

目前也可通过基因克隆的方法制备多克隆抗体［11］。即将目的蛋白克隆并表达，经亲和色谱纯化后作为免疫源去免疫动物而得到相应的多克隆抗体。在本研究中免疫的后续过程是与通过基因工程的方法获取多克隆抗体是一致的，但不同在于免疫源的制备。本研究中的对象为Sm中的EmbB蛋白，它分子质量大，且具有超过10次的跨膜结构域，因而它的表达是非常困难的。事实上，我们也尝试过不同的表达载体和表达菌株，但即使在包涵体中也没有能检测到含有EmbB的融合蛋白的表达，因而也不可能通过上述基因工程的方法获得相应的多克隆抗体。基于此，本研究中尝试选取Sm EmbB蛋白中一小段有特异性的肽，人工合成这段小肽，并将其与一个大分子物质相连接而构建出具有免疫源性的复合物，去制备相应的抗体，并成功获得了抗Sm EmbB抗体。

4 结论

本文应用生物信息资源在Sm EmbB的N端上寻找一段特异性的短肽，并基于此短肽制备它的多克隆抗体。Sm EmbB蛋白多克隆抗体的成功产生，不仅为对Sm EmbB的研究提供了有利的工具，同时也为对其它缺乏特异性抗体的蛋白质的研究提供了新思路:即可利用生物信息手段在研究对象上寻找一段特异的短肽，依据此短肽获得它相应的多克隆抗体。随着蛋白质组学的发展，蛋白质功能的重要性已经越来越为人们所重视，因此对蛋白质的直接研究尤为重要。而对于功能未知的、新的蛋白质的研究，能够拥有特异性检测它的抗体是非常重要的，且是很必要的;特别是不能通过基因操作技术而得到表达的这样一类蛋白质，经常由于缺少相应的特异性抗体而限制了对它的研究。在此，本文建立了这种新的抗体制备方法，解决了对一些蛋白质功能研究中缺乏抗体的困扰，为在蛋白质水平的研究提供了新的思路和手段。虽然本文制备的是Sm EmbB的多克隆抗体，但相信对其它蛋白质的抗体制备也有一定的指导和借鉴意义。

［1］Brennan PJ.Structure，function，and biogenesis of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis［J］.Tuberculosis(Edinb)，2003，83(1-3):91-97.

［2］Brennan P J，Nikaido H.The envelope of mycobacteria［J］.Annu Rev Biochem，1995，64:29-63.

［3］Alderwick L J，Radmacher E，Seidel M，et al.Deletion of Cg-emb in corynebacterianeae leads to a novel truncated cell wall arabinogalactan，whereas inactivation of Cg-ubiA results in an arabinan-deficient mutant with a cell wall galactan core［J］.JBiol Chem，2005，280(37):32362-32371.

［4］Alderwick L J，Seidel M，Sahm H，et al.Identification of a novel arabinofuranosyltransferase(AftA)involved in cell wall arabinan biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis［J］.J Biol Chem，2006，281(23):15653-15661.

［5］Berg S，Starbuck J，Torrelles J B，et al.Roles of conserved proline and glycosyltransferase motifs of EmbCin biosynthesis of lipoarabinomannan［J］.J Biol Chem，2005，280(7):5651-5663.

［6］Escuyer V E，Lety M A，Torrelles J B，et al.The role of the emb A and embB gene products in the biosynthesis of the terminal hexaarabinofuranosyl motif of Mycobacterium smegmatis arabinogalactan［J］.J Biol Chem，2001，276(52):48854-48862.

［7］Belanger A E，Besra G S，Ford M E，et al.The embAB genes of Mycobacterium avium encode an arabinosyl transferase involved in cell wall arabinan biosynthesis that is the target for the antimycobacterial drug ethambutol［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(21):11919-11924.

［8］Alcaide F，Pfyffer G E，Telenti A.Role of embB in natural and acquired resistance to ethambutol in Mycobacteria［J］.Antimicrob A-gents Chemother，1997，41(10):2270-2273.

［9］Plinke C，Rüsch-Gerdes S，Niemann S.Significance of mutations in embB codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates［J］.Antimicrob Agents Chemother 2006，50(5):1900-1902.

［10］ Sreevatsan S，Stockbauer K E，Pan X，et al.Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis:Critical role of embB mutations［J］.Antimicrob Agents Chemother，1997，41(8):1677-1681.

［11］张文利，申 慧，辛 毅，等.耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备［J］.细胞与分子免疫学杂志，2008，24(6):601-603.

Application of bioinformation in achieving polycolonal antibody of EmbB in M.smegmatis

ZHANG Wen-li1，MA Li1，XIN Yi1，XU Yue-fei1，REN Feng1，MA Yu-fang1，2
(1.Dalian Medical University，2.Glycobiology and Glycoengineering Key Lab of Liaoning Province，Dalian 116044，China)

Purpose To build up a new method to make polycolonal antibody of EmbB in M.smegmatis by utilizing bioinformation resource.Methods A peptide of Sm EmbB with 18 amino acids was designed based on to the analysis of bioinformation，and linked with Diphtheria Toxoid to form a complex which was utilized to immune mouse for getting Sm EmbB's polycolonal antibody.Results The antibody achieved can work on Sm EmbB well with being identified by Western blot.Conclusion This method can provide a new point of view to obtain polycolonal antibody for a certain protein without antibody available.

M.smegmatis;EmbB;bioinformation;polycolonal antibody

Q785

A

1005-1678(2012)06-0732-04

2011-12-07

辽宁省高等学校创新团队支持计划(LT2010026)

张文利，女，副教授，微生物的糖生物化学及分子生物学，Tel:0411-86110312，E-mail:zhwenli2004@yahoo.com.cn; 马郁芳，通信作者，教授，博士生导师，Tel:0411-86110338，E-mail:yufang_ma@hotmail.com。