久效磷对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胁迫相关基因mRNA表达的影响＊

田 雨，汝少国

（中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

久效磷对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胁迫相关基因mRNA表达的影响＊

田 雨，汝少国＊＊

（中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

研究了久效磷（Monocrotophos，MCP）对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胁迫相关基因m RNA表达的影响。结果表明久效磷暴露能够导致hsp－16.41、hsp－70、cyp－35a2、vit－2、vit－6和age－1基因表达量显著升高，cep－1、ape－1、sod－1、sod－3、ctl－2、ctl－3、gst－1、daf－12和daf－21基因表达量显著降低，对hsp－16.2、mtl－1和mtl－2基因表达量无显著影响。通过主成分分析发现，久效磷主要影响hsp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1基因表达，这些基因可作为久效磷毒性效应的敏感分子生物标志物。

久效磷（MCP）；秀丽隐杆线虫；胁迫相关基因；mRNA表达

久效磷（Monocrotophos，MCP）是1种广谱类内吸附性有机磷农药（Organophosphorus pesticide，OPs），其残留造成了严重的土壤和水体污染［1－2］。研究表明，久效磷能够对非靶生物产生多种毒性作用。久效磷能够产生细胞毒性，破坏细胞结构，影响细胞特征性酶活力，如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）和谷胱甘肽S转移酶（Gultathione S transferases，GST）等［3－5］。邴欣和田华等［6－7］先后研究证明久效磷对雄性鱼类具有环境雌激素效应。王摆等［8］报道久效磷能够影响细小色矛线虫（Chromadorina germanica）胚胎发育和繁殖。此外，久效磷还具有生殖毒性、神经毒性和遗传毒性等［9－11］。

当生物体受到环境变化或外源污染物胁迫时，其个体生理水平会随之发生响应，如生殖、发育、行为等受到抑制，而这种响应是生物体分子水平响应的表观体现。与个体生理水平响应相比，分子水平响应的敏感性和特异性更高，因此分子水平上的基因表达变化被认为是一种用于污染物早期检测的良好手段［12］。在常用的胁迫相关基因中，热激蛋白（Heat shock protein，HSP）基因可以表征高温等环境影响和外源污染物的毒性效应包括环境雌激素效应［13］，卵黄原蛋白（Vitellogenin，VTG）基因可以表征外源污染物的环境雌激素效应［14］，CYP450、SOD、CAT和GST基因可以表征外源污染物引起的氧化胁迫等细胞毒性［3，5，15］，而金属硫蛋白（Metallothionein，MT）基因则可以表征重金属物质的毒性作用［16］，这些基因为评价和检测外源污染物提供了理想的分子生物标志物。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是第1个基因组被完全测序的多细胞动物，且与脊椎动物基因组相比高度保守，是分子生物学研究中的理想模式生物。同时，由于秀丽隐杆线虫对多种胁迫响应敏感，已被广泛应用于生态毒理学研究。因此，本文选择秀丽隐杆线虫为实验动物，通过实时定量PCR研究久效磷对秀丽隐杆线虫多种胁迫相关基因表达的影响，并通过主成分分析探讨受久效磷影响的主要基因，从而确定久效磷毒性效应的敏感分子生物标志物。

1 材料与方法

1.1 试剂

久效磷农药（O，O－二甲基－2－甲基氨基甲酰基－1－甲基乙烯基磷酸酯，40%水溶性制剂）购自青岛农药厂，商标浓度为40%，利用气相色谱法测得的实际浓度为（40±0.1）%［17］。其余试剂均购自Sigma－Aldrich公司。

1.2 线虫品系及培养

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）品系为野生型N2，由国际线虫遗传中心（CGC）（Minneapolis，MN，USA）赠送，用琼脂培养基（NGM）（3 g·L－1NaCl，2.5 g·L－1蛋白胨，5 mg·L－1胆固醇，1 mmol·L－1CaCl2，1 mmol·L－1MgSO4，25 mmol·L－1磷酸氢钾缓冲液，p H＝6.0，17 g·L－1琼脂）在（20±1）℃条件下恒温培养，喂食大肠杆菌OP50［18］。

1.3 L4期幼虫同步化处理

将怀卵成虫用双蒸水冲洗至15 m L离心管中，用漂白混合液（5 mol·L－1NaOH，5%NaClO）振荡处理10 min，1 300×g离心30 s。随后用双蒸水冲洗后1 300×g离心30 s。收集卵并置于NGM培养基，喂食大肠杆菌OP50，20±1℃培养48 h，获得同步化的L4期幼虫［19］。然后用双蒸水将L4期幼虫冲洗至15 m L离心管，1 000×g离心1 min去上清液，再用K－medium（0.032 mol·L－1KCl，0.051 mol·L－1NaCl）［20］冲洗3次后用于暴露实验。

1.4 急性毒性实验

在24孔板中用K－medium配制久效磷终浓度为864、720、600、500、416、347和289 mg·L－1的1 m L处理液，并设K－medium空白对照组，每组设3个平行样。每孔放入10±1条同步化处理后的线虫，（20±1）℃暴露24 h。在体视显微镜下观察并记录存活和死亡线虫数目，计算线虫存活率。用接种针触碰线虫无反应即为死亡。

1.5 亚致死浓度暴露实验

暴露实验采用直径6 cm灭菌培养皿，每皿加入10 m L久效磷终浓度为0.5、5.0和50.0 mg·L－1的K－medium，久效磷浓度是根据MCP 24－h LC50（494 mg·L－1）的1／1 000、1／100和1／10设置的，每皿接种同步化处理后的L4期幼虫100条［21］，暴露时间24 h，暴露条件为（20±1）℃且不添加食物。

1.6 实时荧光定量PCR

亚致死浓度暴露实验后，收集Young adults线虫，经M9缓冲液（6 g·L－1Na2HPO4，3 g·L－1KH2－PO4，5 g·L－1NaCl，1 mol·L－1MgSO4）和双蒸水冲洗后，用于RNA提取。总RNA提取采用E.Z.N.A.TMMicroEluteTMTotal RNA Kit（Omega Bio－Tek，Inc.，Norcross，GA，USA）。RNA质量根据260和280 nm吸光度比值确定。根据260 nm吸光度确定RNA浓度后，用DNase I（Promega CO.，Madison，WI，USA）进行DNA消化处理。反转录PCR采用First Strand cDNA Synthesis Kit－Rever Tra Aceα－TM（TOYOBO CO.，Osaka，Japan）和Bio－Rad MycyclerTMThermal Cycler（Bio－Rad，Hercules，CA，USA）。根据C.elegans数据库（www.wormbase.org）设计引物（见表1），其中act－1和rpa－1为内参基因。实时荧光定量PCR在Eppendorf Mastercycler?ep realplex2（Eppendorf AG，Barkhausenweg，Hamburg，Germany）中运行，20μL real－time PCR反应体系中含有10μL Platinum?SYBR?Green qPCR Super Mix－UDG，0.4μL 10 mmol·L－1正反向引物，0.4 μL ROX参考染料（Invitrogen CO.，Carlsbad，California，USA）和0.8μL第一链cDNA（模板），反应程序95℃30 s；95℃5 s，61℃30 s，40 cycles；融解曲线为95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，从61～95℃每上升0.5℃取一次荧光值。采用参照基因的△C t法（2ΔCt）计算目的基因表达值，其中ΔC t＝［C t（act－1）＋C t（rpa－1）］／2－C t（目的基因），并进行对数转换。

表1 Real－time PCR引物序列Table 1 Primers for real－time PCR amplification

续表1

1.7 数据处理

LC50通过概率分析法获得。其他数据均以平均值±标准差表示并用SPSS 16.0进行数据分析。采用单因素方差分析（one－way ANOVA）进行对照组和处理组比较，0.01＜P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。对具有显著性差异的基因表达结果进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），取特征根数值为1，迭代次数为200。

2 结果

2.1 久效磷对秀丽隐杆线虫胁迫相关基因表达的影响

久效磷暴露对秀丽隐杆线虫胁迫相关基因表达量影响见图1。

图1 久效磷对秀丽隐杆线虫胁迫相关基因表达量的影响Fig.1 Effects of MCP on the expression of stress－related genes of C.elegans

经久效磷暴露后，与对照组相比，环境雌激素效应相关基因hsp－16.41表达量随久效磷浓度升高而极显著升高（P＜0.01），hsp－70表达量在50 mg·L－1久效磷暴露组显著升高（0.01＜P＜0.05），vit－2表达量在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露组极显著升高（P＜0.01），vit－6表达量在0.5 mg·L－1久效磷暴露组极显著降低（P＜0.01），而在50 mg·L－1久效磷暴露组极显著升高（P＜0.01），hsp－16.2表达量在各久效磷暴露组均无显著性变化。

经久效磷暴露后，与对照组相比，细胞毒性相关基因cyp－35a2表达量在50 mg·L－1久效磷暴露组极显著升高（P＜0.01），sod－1和ctl－2表达量在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露组极显著降低（P＜0.01），sod－3表达量在50 mg·L－1久效磷暴露组极显著降低（P＜0.01），ctl－3表达量在0.5 mg·L－1久效磷暴露组极显著降低（P＜0.01），gst－1表达量随久效磷浓度升高而极显著降低（P＜0.01）。

经久效磷暴露后，与对照组相比，发育相关基因daf－12和daf－21表达量在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露组均极显著降低（P＜0.01），age－1表达量在5.0 mg·L－1久效磷暴露组极显著升高（P＜0.01），ape－1表达量在0.5 mg·L－1久效磷暴露组极显著升高（P＜0.01），而在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露组均极显著降低（P＜0.01），cep－1表达量在各久效磷暴露组均极显著降低（P＜0.01）。

经久效磷暴露后，与对照组相比，金属胁迫相关基因mtl－1和mtl－2表达量在各久效磷暴露组均无显著性变化。

2.2 久效磷对秀丽隐杆线虫胁迫相关基因表达影响的主成分分析

对基因表达存在显著差异的15个胁迫相关基因进行主成分分析，数据矩阵的特征值、各特征值的百分率和累计贡献率见表2。各特征值相应的特征向量就是久效磷对不同胁迫相关基因表达影响的权重系数，选择特征值＞1的前几个主成分作为从不同方面表征久效磷m RNA水平上的主要毒性效应。从表2可以看出，特征值＞1的3个主成分的累计贡献率已达到100%，说明3个主成分就能够完全反映久效磷m RNA水平上的主要毒性效应。

表2 样本相关矩阵的特征值、贡献率及累积贡献率Table 2 The eigenvalues，contribution and cumulative contribution of matrix

主成分负荷情况见表3。从表3可以看出，第一主成分的特征值为10.87，贡献率为72.44%，其特征向量中载荷较高的是ctl－2（0.986）和hsp－70（－0.968），主要表征久效磷的细胞毒性和环境雌激素效应。第二主成分的特征值为2.87，贡献率为19.12%，其特征向量中载荷较高的是ctl－3（0.901）和cep－1（0.732），主要表征久效磷的细胞毒性和发育毒性。第三主成分的特征值为1.27，贡献率为8.43%，其特征向量中载荷较高的是vit－2（0.584）和age－1（0.548），主要表征久效磷的环境雌激素效应和神经毒性。

表3 主成分负荷表Table 3 Component matrix

3 讨论

基因表达指标不仅在评价外源化合物作用中敏感、有效，还可以根据目标基因的特性确定外源化合物某些特定类型的毒性作用。本文以秀丽隐杆线虫为实验动物研究了久效磷对多种胁迫相关基因表达的影响。

HSP和VTG是雌激素胁迫相关蛋白，在具有雌激素活性物质作用下其表达会明显升高。Lu等［13］报道17－β－雌二醇能够造成hsp－25／27和hsp－70蛋白表达增加。Tian等［14］报道久效磷能够引起雄性金鱼VTG mRNA表达升高并诱导产生VTG，表现出雌激素活性。本文中，秀丽隐杆线虫的hsp－16.41、hsp－70、vit－2和vit－6在久效磷暴露下mRNA表达量均显著升高，与其他学者研究结果相一致，进一步证明了久效磷具有环境雌激素效应。

通常情况下，生物体内都存在一套解毒系统以抵抗外界环境变化和外源化合物胁迫。秀丽隐杆线虫与其他脊椎动物类似，也是主要通过多种解毒酶来完成解毒过程。SOD是生物体内抵抗氧化胁迫的重要活性物质，能够通过清除氧自由基维持生物体处于正常状态。过氧化氢作为代谢废物能够对生物体造成损害，而CAT能够通过催化过氧化氢分解保持机体健康。GST可以催化谷胱甘肽与各种亲电子外源化学物质结合，从而避免外源化学物质在生物转化中形成某些生物活性中间产物与细胞生物大分子重要成分共价结合对机体造成损害，起到解毒作用。研究表明这些解毒酶活性在久效磷作用下都会受到抑制作用。唐学玺等［22］和白洁等［23］分别发现久效磷能够导致藻类和对虾SOD活性降低，Kavitha和Rao［5］发现久效磷导致鱼类SOD和CAT活性均降低，Siddiqui等［24］报道久效磷能够抑制大鼠GST活性。本文中sod－1、sod－3、ctl－2、ctl－3、gst－1在久效磷暴露下表达量均降低，在mRNA水平上验证了久效磷对SOD、CAT和GST活性的抑制作用，表明久效磷能够扰乱解毒过程产生细胞毒性。然而，与其他解毒酶相比，CYP450结果却截然相反，cyp－35a2表达量显著升高。大量研究结果表明生物体受到外源化学物质胁迫后，会通过提高细胞色素P450酶基因表达进而催化外源化学物质的活化代谢，以缓解毒性［15，25－26］。同时，本文认为这种解毒能力的增强使得秀丽隐杆线虫拥有了有效的防御系统以抵抗久效磷引起的损伤。

秀丽隐杆线虫发育过程中包括一个可选择的dauer期，当L1期和L2期秀丽隐杆线虫在不适环境条件下就会进入dauer期，而控制这一过程的就是daf基因［27］。作为2种类型的daf基因，daf－12编码一种调节dauer形成的类固醇激素受体［28］，而daf－21编码一种hsp90家族的分子伴侣，daf－21活性是幼虫发育过程中所必需的［29］。久效磷造成daf－12和daf－21表达降低表明久效磷作为一种环境胁迫因子能够影响秀丽隐杆线虫dauer形成并影响其发育过程，产生发育毒性。除daf基因外，age－1也与dauer幼虫形成有关。age－1是胰岛素样信号途径组成成分之一，而胰岛素样信号途径除与dauer幼虫形成有关，同时age－1途径还与调节生命周期［30］和化学趋向性密切相关［31］。而实验室之前的研究表明久效磷能够导致秀丽隐杆线虫化学趋向性缺陷，结合age－1基因表达量升高的结果进一步说明了久效磷可能通过作用于age－1途径而产生化学趋向性缺陷，表现出一定的神经毒性。本文推测age－1基因表达量的升高可能有2种原因：一是由于久效磷导致秀丽隐杆线虫化学趋向性缺陷后，age－1通过提高表达水平启动age－1途径补救机制而造成的；二是可能与氧化胁迫有关，Barsyte等［30］报道氧化胁迫能够加速细胞衰老，而age－1是细胞衰老速率的重要调节因子，由于久效磷能够产生氧化胁迫能力，就可能通过增加age－1基因表达量来加速细胞衰老。细胞衰老到最后就表现细胞凋亡，两者也都是发育过程中的必经阶段。cep－1编码人肿瘤抑制基因p53的直系同源基因，是DNA损伤引起的细胞凋亡过程中所必需的；ape－1是cep－1的保守抑制因子，在缺失的情况下能够导致cep－1控制的细胞凋亡增加［32］。而对于久效磷造成的cep－1和ape－1表达量同时降低原因还不清楚，需要在今后的工作中进一步研究。

以上研究结果表明，久效磷能够导致多种胁迫相关基因表达量显著变化，而这些基因表达量的变化可以表征久效磷的多种毒性作用。hsp－16.41、hsp－70、vit－2和vit－6基因表达量的变化可以表征久效磷的环境雌激素效应，cyp－35a2、sod－1、sod－3、ctl－2、ctl－3和gst－1基因表达量的变化可以表征久效磷的细胞毒性，cep－1、ape－1、daf－12和daf－21基因表达量的变化可以表征久效磷的发育毒性，age－1基因表达量的变化可以表征久效磷的神经毒性。其中，cyp－35a2和vit－2表达量受久效磷影响变化最大，表明细胞毒性和环境雌激素效应可能是久效磷的主要毒性作用。为验证这一推测，本文通过主成分分析，从多个变量的线性变换筛选出少数重要变量，确定受久效磷影响的主要基因。本文通过主成分分析发现，hsp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1在主成分的特征向量中载荷较高，其中第一主成分的贡献率达到了72.44%，而ctl－2和hsp－70在第一主成分中载荷较高，表明久效磷主要影响hsp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1基因表达，尤其是ctl－2和hsp－70基因表达。这些主要受影响基因表达量的变化表征了久效磷的细胞毒性、环境雌激素效应、发育毒性和神经毒性。

大量实验结果也证明久效磷的主要毒性作用集中于上述几种毒性作用。邴欣等［4］报道久效磷能够通过损伤真鲷（Pagrosmus major）鳃、肝、肾细胞内主要细胞器产生细胞毒性。邴欣等［6］报道0.01、0.1和1.0 mg·L－1久效磷均能诱导雄性金鱼分泌卵黄原蛋白，并且能够明显抑制金鱼精巢γ－谷胺酰转移酶（γ－GTP）活性，造成金鱼精巢支持细胞的细胞膜、核膜和线粒体嵴部分溶解，以及脂滴增加，胞质内出现髓磷脂象，表明久效磷可能具有环境雌激素活性。王摆［33］报道久效磷能够严重抑制细小色矛线虫（Chromadorina germanica）胚胎发育和繁殖，具有发育和生殖毒性。房燕［34］报道久效磷能够损伤金鱼（Carassius auratus）精巢支持细胞、leydig氏细胞及精子线粒体结构，并影响SOD等多种特征性酶活性，同时久效磷还能降低精子运动力，损伤精子DNA，最终影响生殖和发育。Rajinia等［35］报道低浓度久效磷在严重抑制秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，ACh E）活性的同时，也造成了秀丽隐杆线虫平均运动速率的下降，表现出严重的神经毒性。姚丹［36］报道久效磷不仅通过胆碱能系统发挥神经毒性作用，还能通过扰乱马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）多巴胺和血清素等非胆碱能系统产生神经毒性。随着研究的深入，逐渐证实久效磷具有环境雌激素效应。姜雪［37］报道久效磷在发挥其环境雌激素效应过程中，能够通过调节性激素水平干扰GH／IGF－I轴从而抑制金鱼（Carassius auratus）生长产生发育毒性。田华［7］从性腺性激素合成与转化、垂体促性腺激素（Gonadotropins，Gt Hs）合成与分泌、下丘脑促性腺激素释放激素（Gonadotropin－releasing hormones，Gn RHs）调控3个层次，研究了久效磷对雄性、雌性金鱼（Carassius auratus）下丘脑－垂体－性腺轴的干扰作用，探讨了久效磷环境雌激素作用机制，并认为久效磷能够通过干扰生殖轴线产生生殖毒性。

综上，统计学分析和实验结果均验证了本文对于久效磷主要毒性作用的推测，而表征久效磷主要毒性作用的相关基因则可以作为久效磷的敏感分子生物标志物，用于环境检测和毒性评价。

4 结语

本文研究了久效磷对秀丽隐杆线胁迫相关基因m RNA表达的影响，从m RNA水平上表征了久效磷的细胞毒性、环境雌激素效应、发育毒性和神经毒性，并通过主成分分析确定了受久效磷影响的主要基因为hsp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1，这些基因可以作为久效磷的敏感分子生物标志物，用于环境检测和毒性评价。

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［35］ Rajini P S，Melstrom P，Williams P L.A comparative study on the relationship between various toxicological endpoints in Caenorhabditis elegans exposed to organophosphorus insecticides［J］.Journal of Toxicology and Environmental Health Part A，2008，71（15）：1043－1050.

［36］ 姚丹.久效磷对马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）胚胎发育神经毒性效应研究［D］.青岛：中国海洋大学，2010.

［37］ 姜雪.久效磷对早期生长发育阶段斑马鱼（Danio rerio）GH／IGF－I轴的影响［D］.青岛：中国海洋大学，2009.

Effects of Monocrotophos on the mRNA Expression of Stress－Related Genes of Caenorhabditis elegans

TIAN Yu，RU Shao－Guo
（College of Marine Life Science，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Effects of monocrotophos（MCP）on the m RNA expression of stress－related genes of Caenorhabditis elegans were investigated in this research.Treatment with MCP resulted in significant increases of hsp－16.41，hsp－70，cyp－35a2，vit－2，vit－6 and age－1 m RNA expressions，significant decreases of cep－1，ape－1，sod－1，sod－3，ctl－2，ctl－3，gst－1，daf－12 and daf－21 mRNA expressions，and indistinctive changes of hsp－16.2，mtl－1 and mtl－2 mRNA expressions.Principal component analysis indicated that MCP mainly influences mRNA expressions of hsp－70，ctl－2，ctl－3，vit－2，cep－1 and age－1 genes，which therefore could serve as sensitive molecular biomarkers for the toxicity of MCP.

monocrotophos（MCP）；Caenorhabditis elegans；stress－related genes；mRNA expression

X171

A

1672－5174（2012）03－050－07

国家自然科学基金项目（30671618）资助

2011－04－18；

2011－08－29

田 雨（1983－），男，博士生。E－mail：rainchildren＠163.com

＊＊通讯作者：E－mail：rusg＠ouc.edu.cn

责任编辑 朱宝象