噁喹酸在大菱鲆体内的药代动力学研究＊

孙爱荣，李 健，常志强，梁俊平

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，山东青岛266071）

噁喹酸在大菱鲆体内的药代动力学研究＊

孙爱荣1，2，李 健2＊＊，常志强2，梁俊平2

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，山东青岛266071）

采用高效液相色谱法，研究了（24.5±0.2）℃水温条件下单次静注和口服给药后噁喹酸在健康大菱鲆体内的代谢动力学规律。结果显示，大菱鲆单次口服噁喹酸（20 mg／kg）后，药物在血浆中经时过程符合一级吸收二室开放模型，表达方程为C口服＝2.059e－0.062t＋0.645e－0.023t－2.704e－0.202t，单次静注噁喹酸（10 mg／kg）后，药物在血浆经时过程符合无级吸收二室开放模型，表达方程为C静注＝12.284e－0.144t＋0.284e－0.027t。血浆中的主要药动学参数，静注的t1／2α（4.813 h）、t1／2β（25.441h）、tmax（0.083 h）均小于口服给药（11.26、30.212、6 h）。结果表明，静注噁喹酸在大菱鲆体内的吸收、消除速度，达峰时间均快于口服给药。根据本实验的结果，噁喹酸的合理给药方案为：建议口服给药按鱼体重21.41 mg／kg，每日1次给药，连用5～7 d。

大菱鲆；噁喹酸；药代动力学；给药方案

大菱鲆（Scophthalmus maximus），英文名为Turbot，是原产于欧洲沿海的一种名贵比目鱼，在中国又称多宝鱼，隶属于硬骨鱼类、鲽形目、鲆科、菱鲆属［1］。大菱鲆于1992年引入我国，由于其生长快，营养价值高等优点而成为我国北方特别是山东半岛地区的主要海水养殖鱼类。

噁喹酸（Oxolinic acid，OA），又称氧环噁喹酸、奥基索林酸或奥林酸，是第二代喹诺酮类产品，具有广谱、用量低、抑菌效果好等优点，对鳗弧菌（Vibrio anguillarum），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等病原菌有较强的抗菌活性，是治疗水产动物疾病较为理想的药物之一［2］。目前已见噁喹酸在鲈鱼（Cuvier et Valenciennes）、鳗鱼（Muraenesoxci nereus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、三角鲂（Megalobrama terminalis）、中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）、金头鲷（Sparus Aurata）、大西洋鲑（Salmo salar）、石斑鱼（Epinephelus drummondhayi）［1－10，12，14］等体内的药代动力学研究报道，而关于其在大菱鲆体内的药代动力学还未见相关报道。本试验研究了静注和口服两种给药方式下，噁喹酸在大菱鲆体内的代谢动力学规律，并提出合理的给药方案，以期为指导大菱鲆养殖生产中的合理用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 健康大菱鲆（Scophthltmus maximus），体重（154.7±10.4）g，饲养于中国水产科学研究院黄海水产研究所烟台海阳实验基地。水温（24.5±0.2）℃连续充气，流水条件下暂养两周，实验前检测无药物残留，投喂大菱鲆专用配合饲料。

1.1.2 试验药品及试剂 噁喹酸标准品，纯度≥99%，购自中国兽药监察所；噁喹酸钠原粉（纯度≥99%，批号7789－38－0），由武汉昌恒生物制品研究所生产。乙腈为色谱纯，乙酸乙酯、无水硫酸钠、草酸、氢氧化钠、正己烷为分析纯。

1.1.3 试验仪器及设备 Agilent1100型高效液相色谱仪（HPLC），配有四元泵（G1311A）；G1321A荧光检测器；50μL液相色谱专用微量注射器；PA／SA精密电子天平；SB5200超声波清洗机；SZ－93自动双重纯水蒸馏器；KL512型恒温水浴氮吹仪，XHF－1型高速分散器，Eppendorf高速离心机，漩涡振荡器。

1.2 试验方法

1.2.1 给药方法及采样 口服给药及采样：用干净毛巾固定鱼体，用弃去针头的1 m L无菌注射器吸取噁喹酸水溶液灌入大菱鲆前胃，口服剂量依据《新编渔药手册》的推荐剂量选择20 mg／kg，观察有回吐者弃去，无回吐者用于试验。分别于口服给药后的0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、16、24、36、48、60、72 h尾静脉无菌取血，放入预先涂有1%肝素钠的5 m L离心管，5 000 r／min，离心10 min，取上层血浆，于－20℃冰箱保存。同时取大菱鲆肌肉、肾脏和肝脏样品，于－20℃冰箱保存。同一时间点取5尾鱼。

静注给药与采样：用干净毛巾擦干鱼体左侧，酒精棉消毒，尾静脉注射剂量依据《新编渔药手册》的推荐剂量以及预实验结果，选择尾静脉注射10 mg／kg，取样时间和方式同口服给药。所有样品置20℃冰箱冷冻保存。

1.2.2 样品预处理 血浆处理：血浆样品于室温下自然解冻后，摇匀后吸取1 m L于10 m L离心管，加入2 m L无水硫酸钠，加入4 m L无水乙酸乙酯，漩涡振荡器振荡20 s，静置2 h，5 000 r／min离心10 min，取上清液，于40℃恒温水浴下氮气吹干，1 m L流动相溶解残渣，加入2 m L正己烷去脂肪，振荡静置，弃去上层液体，下层液过0.22μm的微孔滤膜，过滤后的液体进行高效液相色谱测定。

组织处理：组织样品于室温下自然解冻后，准确称取1 g组织（肌肉、肝脏、肾脏），加入2 m L无水硫酸钠，2 m L无水乙酸乙酯，16 000 r／min匀浆30 s，再用2 m L乙酸乙酯清洗刀头，合并2次提取液，振荡30 s，静置2 h，5 000 r／min离心10 min，取上清液，于40℃恒温水浴下氮气吹干，1 mL流动相溶解残渣，加入2 mL正己烷去脂肪，振荡静置，弃去上层液体，下层液过0.22μm的微孔滤膜，过滤后的液体进行高效液相色谱测定。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为Agilent TC－C18（4.6 mm×250 mm，填料粒度5μm）；流动相由乙腈和0.1%草酸（用NaOH调至p H＝3.0）按30∶70（V／V）的比列混合而成；荧光检测器的激发波长为325 nm，发射波长为369 nm；柱温30℃；流速1.0 m L／min，进样量20μL。

1.2.4 线性范围 准确称取噁喹酸标准品0.01 g，用适量NaOH助溶，然后用流动相定容至100 m L，配成100μg／m L的母液，再依次用流动相稀释成50.00、10.00、5.00、2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01μg／m L的标准溶液用HPLC进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线，进行回归分析，分别求出回归方程和相关系数。

1.2.5 回收率、精密度和最低检测限 取0.1、1、10 μg／m L 3个浓度水平的噁喹酸标准液各1 m L，分别加入1 g肌肉、鳃、肝脏、肾脏和1 m L血浆5种空白组织中，每个浓度有3个平行，按1.2.2处理样品后进行HPLC测定，按照公式进行计算：回收率（%）＝（实测药物浓度／理论药物浓度）＊100%。

将上述样品于1 d内分别重复进样5次和分5 d测定，计算3个浓度水平响应值峰面积的变异系数（C.V%），以此衡量方法的精密度。

1.2.6 数据处理 采用DAS2.0药动学软件对药时数据进行分析，并计算主要参数（分布相半衰期t1／2α、消除相半衰期t1／2β、表观分布容积Vd／F、总体清除率CL／F、曲线下面积AUC、达峰时间T max、峰浓度C max）。

2 结果与分析

2.1 线性范围

噁喹酸标准液在0.01～50.00μg／m L浓度范围内有良好的相关性，线性回归方程为Y＝117.14 X＋21.396，R2＝0.999 7，标准曲线见图1。

图1 噁喹酸标准工作曲线Fig.1 Standard curve of oxolinic acid

2.2 回收率、精密度和最低检测限

本实验条件下，噁喹酸在血浆和各组织中的回收率在77.9%～100.62%之间（见表1），日内精密度为（2.14±1.09）%，日间精密度为（3.26±2.12）%，本方法的检测限为0.02μg／m L，符合药物分析的要求。

表1 噁喹酸在血浆和各组织中的回收率Table 1 Recovery of oxolinic acid in plasma and tissue of Scophthalmus maximus

2.3 噁喹酸在大菱鲆体内的浓度变化

大菱鲆一次性口服和静注噁喹酸后，药物在血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的药—时曲线（见图2～4）。口服噁喹酸后，血浆和各个组织均有明显的双峰现象。静注后0.083 h血浆即达到了最高浓度，1 h左右各个组织浓度也达到最高值，随后下降。

图2 噁喹酸在血浆中的药－时曲线Fig.2 Mean oxolinic acid concentration in plasma of Scophthalmus maximus after intravenous（10 mg／kg）and oral administration（20 mg／kg）

图3 大菱鲆口服噁喹酸后各组织中的药－时曲线Fig.3 Mean oxolinic acid concentration in tissue of Scophthalmus maximus after oral administration of 20 mg／kg

图4 大菱鲆静注噁喹酸后各组织中的药－时曲线Fig.4 Mean oxolinic acid concentration in tissue of Scophthalmus maximus after intravenous administration of 10 mg／kg

表2 大菱鲆单次静注和口服噁喹酸的药物代谢动力学参数Table 2 Pharmacokinetic parameters of single oxolinic acid following intravenous and oral administration to Scophthalmus maximus

2.4 噁喹酸在大菱鲆体内的药物代谢动力学参数

大菱鲆分别以20 mg／kg剂量一次性口服和10 mg／kg剂量一次性静脉注射噁喹酸后，其药时数据用DAS2.0软件进行分析处理，结果表明，静注给药的药时数据均符合无级吸收二室开放模型；口服给药的药时数据没有经过自调处理，多峰现象比较严重，本实验口服分析参考房室参数值和非房室模型统计矩原理来分析药时数据［2，11］；其血浆药代动力学方程分别为：C静注＝12.284e－0.144t＋0.284e－0.027t和C血浆＝2.059 e－0.062t＋0.645e－0.023t－2.704e－0.202t。主要药动学参数见表2。

3 讨论

3.1 噁喹酸在大菱鲆体内的药代动力学特征

本实验首次报道了噁喹酸在大菱鲆体内的药代动力学规律，结果表明，大菱鲆单次静注噁喹酸后血药经时过程符合无级吸收二室开放模型，这与报道的噁喹酸在鳗鱼［4］体内的代谢过程相同。静注给药后，噁喹酸在大菱鲆体内吸收迅速，血浆0.083 h内即达峰浓度，说明静注给药后，药物直接进入血液循环。肌肉、鳃、肝脏、肾脏的药－时曲线趋势一致，血浆及这4种组织的T max分别为0.083、1、0.5、1 h，C max分别为18.828 9、14.021 4、12.750 0、53.660 4μg／g，肾脏＞血浆＞肌肉＞肝脏，肝脏的达峰时间快于其它3个组织，肝脏在代谢过程中主要发挥转化作用，通过氧化和葡萄糖醛酸甙化进行药物代谢，所以肝脏中的药物浓度低于血浆和其它组织。单次静注给药后，血浆t1／2α（11.26 h）大于鳗鱼（0.18 h）［4］、大西洋鲑（0.7 h，0.3 h）［12，14］，这可能是由于种属和环境因素等差异造成的。大量研究结果表明，种间差异大，药代动力学参数差异也大，种间差异小，药代动力学参数差异也小。Ole Bent Samuelsen［25］对噁喹酸在鳕鱼体内的药代动力学进行了研究，并与前人的结论进行了比较，得出噁喹酸的吸收相半衰期、消除相半衰期和生物利用度的种间差异很大。另外Van der Heijden等［26］研究结果表明种间平均体重的不同也可能造成药代动力学参数的不同。

口服给药后，大菱鲆血浆和其它各个组织中均出现明显的多峰现象，这与王慧等［2］研究的噁喹酸在牙鲆体内的代谢规律一致，此类现象在牙鲆口服氯霉素［17］也出现过。口服给药研究数据可以看出，血浆、肌肉、肝脏、肾脏的药－时曲线趋势一致，血浆的T max为6 h，肌肉、肝脏、肾脏的T max均为16 h，血浆的达峰时间快于这3个组织，大菱鲆口服噁喹酸血药达峰时间小于鲈鱼（11.431 h）［3］、三角鲂（16 h）［5］和大西洋鲑（24 h）［12］，大于石斑鱼（5.75 h）［13］、大西洋鲑（3.9 h）［14］。血浆、肌肉、肝脏、肾脏的达峰浓度C max分别为2.270 8 mg／mL、3.845 8 mg／g、7.312 7 mg／g、11.507 1 μg／g，肾脏＞肝脏＞肌肉＞血浆，表明噁喹酸在相同给药剂量下，肾脏、肝脏中的药物浓度要高于肌肉和血浆，说明进入肾脏、肝脏中的药量最多。口服给药后所出现的多峰现象，可能是因为噁喹酸能与鱼体内蛋白质疏松可逆结合，游离型药物与结合型药物之间的动态平衡，使血药浓度再次上升，药物随血液运达其它各个组织，使各个器官组织药物浓度再次达到高峰［2］，另外也可能是由于肠肝循环、胃肠循环、多部位吸收等原因，使某些脏器对药物存在再吸收的作用，使得药物二次吸收，浓度再次升高［18］。本实验没有取鳃组织，水产中药代动力学很少以鳃作为取样组织，类似的现象只在国外的氟甲喹［15］和国内的诺氟沙星［16］出现过。

大菱鲆口服噁喹酸后血浆的消除相半衰期为30.212 h，大于鲈鱼（10.278 h）［3］，而小于大西洋鲑（37.1 h）［14］；大菱鲆静注噁喹酸后血浆的消除相半衰期为25.441 h，大于鳗鱼（14.84 h）［4］、大西洋鲑（10 h，5.1 h）［12，14］。大菱鲆口服噁喹酸血浆t1／2β大于口服磺胺甲基异噁唑（6.32 h）［19］，而小于口服恩诺沙星（99.137 h）［20］、磺胺甲噁唑（273.054 h）［21］、甲氧苄氨嘧啶（40.32 h）［22］、土霉素（219.972 h）［23］，表明不同实验动物对同一种药物的代谢能力不同，不同药物对同一实验动物的代谢规律不同。

不同的给药方式所得的药代动力学参数差异很大，与静注给药相比，口服给药的达峰时间长，达峰浓度低，说明静注噁喹酸在大菱鲆体内的分布速率快于口服给药，同时2种给药方式下，肾脏中的峰浓度都是最高，可以推测肾脏可能是代谢的主要器官。

3.2 噁喹酸给药方案的探讨

探讨给药方案主要是确定给药的剂量和给药的间隔时间，噁喹酸在健康大菱鲆体内的消除半衰期为32.212 h，属慢效消除类，给药间隔应以1 d为宜。给药剂量与最小抑菌浓度（MIC）、给药间隔时间和药代动力学参数有关，噁喹酸对海水海水养殖动物主要致病菌溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌和淡水嗜水气单胞菌有明显的抑制效果，其MIC在3.8～5.6μg／m L之间［3］，根据本实验单次给药药动学参数，通过徐叔云［24］提出的公式计算给药方案：Css＝F×X0／（Vd×K10×τ），（Css：期望达到的稳态血药浓度；F：生物利用度；X0：每日给药剂量；Vd：表观分布容积；K10：药物在中央室消除速率；τ：给药间隔时间）。根据上述公式计算可得，建议口服给药，按鱼体重每次给药剂量为21.41 mg／kg，1 d 1次，连续5～7 d。

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Pharmacokinetics of Oxolinic Acid in Turbot（Scophthalmus maximus）After a Single Oral and Intravenous Administration

SUN Ai－Rong1，2，LI Jian2，CHANG Zhi－Qiang2，LIANG Jun－Ping2
（1.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.The Key Laboratory for Sustainable Utilization of Marine Fishery Resources Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China）

The pharmacokinetics of Oxolinic acid was studied in Scophthalmus maximus by using the high performance liquid chromatography（HPLC）.The study was performed at（24.5±0.2）℃.All the health fish

a single oral administration of OA at a level of 20mg／kg and intravenous administration of OA at a level of 10 mg／kg.The results showed that the hemolymph concentration time course of OA can be described by a two－compartment open model with the first order absorption after a single oral administration.The pharmacokinetic equation was：Cpo＝2.059e－0.062t＋0.645e－0.023t－2.704e－0.202t.The hemolymph concentration－time course of OA can be described by a two－compartment open model with the zero order absorption after a single intravenous administration.The pharmacokinetic equation was：Civ＝12.284e－0.144t＋0.284e－0.027t.The peak time，distribution and elimination half－lives（tmax，t1／2αand t1／2β）by intravenous administration were found to be 0.083，4.813 and 25.441 h which were shorter than 6，11.26 and 30.212 h of oral administration.The results indicated that the peak time，absorption and eliminate speed of intravenous administration were faster than oral administration.The scheme of oxolinic acid was established to fish bacterial diseases，with the dose of 21.41mg／kg at the interval of 1d，continuous 5～7 days by oral administration.

Scophthalmus maximus；oxolinic acid；pharmacokinetics；ddosage regimen

K969.1

A

1672－5174（2012）03－075－05

国家自然科学基金项目（30700617）；公益性农业行业专项（nyhyzx07－046）资助

2011－04－18；

2011－12－13

孙爱荣，（1979－），女，硕士，研究方向为水产药理学。E－mail：sunairong1234＠163.com，Tel：0532－85826690

＊＊通讯作者：Tel：0532－85830183；E－mail：Lijian＠ysfri.ac.cn

责任编辑 徐 环