饲料中过量添加晶体蛋氨酸和蛋氨酸羟基类似物对大菱鲆生长、饲料利用和抗氧化反应的影响＊

侯华鹏，马 睿，张文兵，麦康森

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003）

饲料中过量添加晶体蛋氨酸和蛋氨酸羟基类似物对大菱鲆生长、饲料利用和抗氧化反应的影响＊

侯华鹏，马 睿，张文兵＊＊，麦康森

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003）

以初始体质量为（5.49±0.01）g的大菱鲆幼鱼为实验对象，探讨饲料中过量添加晶体蛋氨酸或蛋氨酸羟基类似物对大菱鲆生长、饲料利用和抗氧化反应的影响。以白鱼粉和豆粕为主要蛋白源，饲料中同时添加0.25%DL－蛋氨酸和0.3%蛋氨酸羟基类似物钙盐（MHA）作为对照，在此基础上分别添加0.5%DL－蛋氨酸、1.25%DL－蛋氨酸、0.59%MHA、1.49%MHA、1.25%DL－蛋氨酸＋0.85%柠檬酸钙，配制出6种实验饲料，使饲料中蛋氨酸和蛋氨酸羟基类似物（H MTBA）含量分别是1.35%、1.83%、2.50%、1.45%、1.37%、2.51%和0.22%、0.22%、0.22%、0.63%、1.38%、0.29%。养殖试验在室内流水系统中进行，持续10周，每个处理设5个重复，每个重复放养大菱鲆幼鱼30尾。结果显示，过量添加DL－蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆幼鱼生长无显著影响（P＞0.05）。过量添加DL－蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆体组分、肥满度（CF）、脏体比（VSI）和肝体比（HSI）均无显著影响（P＞0.05），但柠檬酸钙添加组（处理6）体蛋白含量与基础饲料组相比显著降低（P＜0.05）。对大菱鲆肝脏过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和肝脏硫代巴比妥酸反应产物量（TBARS）进行测定，各处理组间均无显著性差异（P＞0.05）。结果显示，在该实验条件下，过量添加晶体蛋氨酸（1.31～1.73倍）和HMTBA（1.32～1.75倍）对大菱鲆幼鱼的生长、饲料利用和抗氧化反应没有显著影响。

大菱鲆；DL－蛋氨酸；蛋氨酸羟基类似物；生长性能；抗氧化

鱼粉是饲料工业生产中十分重要的蛋白来源，但目前由于各种原因造成供需矛盾突出，已经成为一种世界范围内越来越短缺的资源［1］。因此，寻求鱼粉替代品的研究已成为水产饲料的一个重要课题［2］。相对动物蛋白而言，植物蛋白源价格低廉且来源广泛，是替代鱼粉的理想蛋白源［3］。但是因为大部分植物蛋白源都不能满足鱼体必需氨基酸的需要，因此以植物蛋白源为基础料的饲料需要补充部分外源氨基酸以满足必需氨基酸的需要［4－6］。

蛋氨酸是鱼类饲料中典型的限制性氨基酸，属含硫氨基酸，不但参与体内蛋白质合成，为S－腺苷蛋氨酸、肌酸、胆碱等物质的合成提供甲基；而且还参与体内各种含硫化合物如谷胱甘肽、牛磺酸等的合成。作为必需氨基酸，饲料中蛋氨酸缺乏时会导致鱼类摄食减少、生长受阻、饲料利用率和蛋白沉积率降低，以及白内障的发生和死亡率的增加［7－16］。同时，研究表明在蛋氨酸缺乏的基础饲料中逐渐提高蛋氨酸的添加量，牙鲆、北极红点鲑、大西洋鲑和斜带石斑鱼的增重率和生长速度逐渐提高［15，17－19］。因此，在饲料中添加蛋氨酸是解决植物蛋白中蛋氨酸缺乏的有效途径。

目前，关于水生动物对晶体氨基酸的利用有一些研究，比较一致的看法是，鲑鳟鱼类能有效利用饲料中添加的外源晶体氨基酸，而虾类及无胃的鲤科鱼类对饲料中添加的晶体氨基酸不能利用或利用效果不明显［20］。Helena的研究表明大菱鲆幼鱼饲料中19%的完整蛋白可以被晶体氨基酸替代而对鱼体生长没有显著影响［21］。对其它一些海水鱼类的研究也表明，饲料中补充晶体蛋氨酸，可有效地促进其生长［22－24］。另一方面，晶体氨基酸的利用效果与其添加形式有关。在饲料工业中广泛使用的蛋氨酸添加剂主要有2类：一类是L－蛋氨酸或DL－蛋氨酸，另一类是商品名为MHA的DL－蛋氨酸羟基类似物（4－甲硫基－2－羟基丁酸，HMTBA）及其钙盐［17］。L－蛋氨酸、DL－蛋氨酸和蛋氨酸羟基类似物（HMTBA）等外来蛋氨酸源的生物学效价各有不同。Keembiyehett和Gatlin［25］对杂交鲈鱼（Moronechrysops♀×M.saxatilis♂）的试验表明，饲料中添加L－蛋氨酸、DL－蛋氨酸、N－乙酰基－DL－蛋氨酸后鱼体增重率、摄食率和蛋白质效率均明显升高，而HMTBA促进生长的效率为L－蛋氨酸的75%。同时，Kelly等［26］对鲈鱼（Moronechrysops♀×M.saxatilis♂）的研究表明以增重率作为评价指标，HMTBA促进生长的效率为L－蛋氨酸的83%。Goff和Gatlin［27］研究表明以眼斑拟石首鱼（Sciaenops ocellata）生长指标作为评价依据，HMTBA具有和L－蛋氨酸相同的促生长作用。因此，晶体蛋氨酸和HMTBA均可以有效改善蛋氨酸和胱氨酸缺乏的饲料［28］。

大菱鲆（Scophthatmus maximus L.）在分类上属于硬骨鱼纲（Osleichthyes）、鲽形目（Pleuronectiformes）、鲽亚目（Pleuronectoidei）、鲆科（Bothidae）、菱鲆属（Scophthalmus），为原产于欧洲的重要海水名贵养殖良种［29］，是世界市场公认的优质比目鱼类之一。1992年引进我国，在国内俗称“多宝鱼”，具有经济价值高、生长迅速、饵料转换率高、活动量小、耗氧量低、适合密养等特点［30］。现已迅速发展成为我国北方优势养殖鱼种，取得了良好的经济和社会效益。

鱼类不但对氨基酸总量有一定的需求，而且要求氨基酸平衡。如果饲料中某种必需氨基酸缺乏或过量，均会产生不良影响。饲料中蛋氨酸过量引起的生长和饲料利用下降有很多报道［31－32］。但也有一些研究则表明随着饲料中蛋氨酸过量添加，鱼类生长相对稳定［33－35］。目前关于大菱鲆氨基酸的需求已有部分研究［36］，并以饲料系数为评判标准确定大菱鲆幼鱼的蛋氨酸需要量为1.52%，占饲料蛋白质的3.20%。本研究的目的是通过分析饲料中过量添加晶体蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆幼鱼生长、饲料利用和抗氧化反应的影响，为这2种营养性添加剂在大菱鲆饲料中的正确使用提供基础数据。

表1 饲料配方组成（%干物质）Table 1 Composition of the experimental diets（%dry matter）

1 材料与方法

1.1 饲料配方和制作

实验饲料配方设计和成分见表1。基础饲料以白鱼粉、豆粕、啤酒酵母和小麦粉为蛋白来源；以鱼油、大豆卵磷脂为脂肪来源；同时以大菱鲆鱼体氨基酸组成［37］为依据添加部分晶体氨基酸（0.25%DL－蛋氨酸、0.3%MHA、0.5%L－赖氨酸和0.3%L－苏氨酸）（见表1）。处理1饲料中粗蛋白和粗脂肪含量分别为46.44%和11.37%，满足大菱鲆基本营养需求［38］。另外5组实验饲料是在处理1的基础上分别添加0.5%DL－蛋氨酸、1.25%DL－蛋氨酸、0.59%MHA、1.49%MHA、1.25%DL－蛋氨酸＋0.85%柠檬酸钙（见表1）。用全自动氨基酸分析仪（Biochrom 30，England）测得从处理1到处理6饲料中蛋氨酸的实际含量分别为1.35%、1.83%、2.50%、1.45%、1.37%、2.51%；用高效液相色谱仪（HPLC，HP1100，USA）测定饲料中HMTBA的实际值分别为：0.22%、0.22%、0.22%、0.63%、1.38%、0.29%。

饲料原料粉碎过筛后，按逐级放大法混合均匀，加鱼油搅拌均匀后加水制成有一定硬度的面团，用双螺杆挤压机（F－26（Ⅱ），华南理工大学）压出颗粒（1.5 mm×2.0 mm）饲料，50℃烘干后－20℃保存备用。

1.2 动物饲养管理

大菱鲆幼鱼选用烟台海阳市黄海水产有限公司当年孵化的同批鱼苗。实验开始前鱼苗在室内流水养殖系统内暂养，使用处理1饲料驯化2周使其适应实验饲料。驯化结束后停食24 h，然后挑选体格健壮，规格均一的大菱鲆幼鱼（5.49±0.01）g进行分组。

实验设6个处理，每个处理5个重复，每个重复放养30尾大菱鲆。实验期间每日饱食投喂2次（上午08：00，下午19：00），每日投喂后吸污及换水2次以保持水质，同时收集残饵烘干称重以获得饲料摄食量。实验期间记录死鱼数量及其体质量。实验采用室内流水系统，每个养殖桶为300 L；持续充气，流水速度不小于2 L／min，水温19～24℃，盐度24～26‰，溶氧含量≥7 mg／L，p H＝7.9～8.05，养殖实验持续10周。

1.3 取样及样品分析

实验开始前随机取6尾鱼用作样品待测。实验结束时，停喂实验鱼24 h，对每桶实验鱼进行记数和称重。然后每桶随机取15尾，6尾用于测定鱼体组分，－20℃保存；3尾分别测其体质量、体长、内脏团质量和肝脏质量；3尾在冰上迅速解剖，取肝脏液氮速冻，后转到－80℃保存。

饲料及鱼体样品均按照AOAC［39］方法进行生化组成分析。其中，水分含量测定于105℃烘至恒重；采用凯氏定氮法测定样品粗蛋白含量；采用索氏抽提法，以乙醚为抽提剂测定粗脂肪含量；灰分测定于马福炉中550℃下灼烧至恒重。

肝脏过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性采用试剂盒测定（南京建成生物工程研究所）。肝脏硫代巴比妥酸反应产物值（TBARS）的测定采用硫代巴比妥酸反应物试剂盒（DTBA－100，博世生物技术有限公司）。

1.4 计算公式

存活率（Survival rate，%）＝100×终末尾数／初始尾数

特定生长率（Specific growth rate，%／d）＝100×（ln终末体质量－ln初始体质量）／试验天数

饲料干物质转化率（Feed conversion efficiency，%）＝100×鱼体质量增加量（g）／饲料消耗量（g）

蛋白质效率（Protein efficiency ratio）＝鱼体质量增加量（g）／蛋白质摄入量（g）

蛋白质沉积效率（Productive protein value，%）＝100×体组织蛋白质沉积量（g）／蛋白质摄入量（g）

摄食率（Feeding intake，%／d）＝100×饲料消耗量（g）×2／（初始体质量（g）＋终末体质量（g））／试验天数（d）

肥满度（Condition factor，g／cm3）＝100×鱼体质量（g）／（体长×体长×体长）（cm3）

肝指数（Hepatosomatic index，%）＝100×肝脏质量（g）／鱼体质量（g）

内脏指数（Viscerosomatic index，%）＝100×内脏团质量（g）／鱼体质量（g）

1.5 数据分析方法

实验所得数据用平均值±标准误表示，所有数据用SPSS16.0软件进行单因数方差（ANOVA）分析。如果差异显著（P＜0.05），再进行Tukey多重比较（Tukey HSD test）。

2 实验结果

2.1 饲料中过量添加蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆存活和生长性能的影响

饲料中添加过量晶体蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆存活率（SR）、摄食率（FI）、饲料干物质转化率（FCE）、特定生长率（SGR）、蛋白质效率（PER）和蛋白质沉积效率（PPV）没有显著影响（P＞0.05），但FI、SGR和PPV随着饲料蛋氨酸的添加量的增加（处理1、处理2和处理3）和HMTBA添加量的增加（处理1、处理4和处理5）有变小的趋势（见表2）。处理3组的大菱鲆SR、SGR和PER最低，在此基础上添加0.85%柠檬酸钙（处理6）后这些指标均有所提高。

表2 不同实验饲料对大菱鲆摄食率、特定生长率、饲料干物质转化率、蛋白质效率、蛋白质沉积效率和存活率的影响①Table 2 Feed intake（FI），specific growth rate（SGR），feed conversation efficiency（FCE），protein efficiency ratio（PER），productive protein value（PPV）and survival rate（SR）of turbot fed different experimental diets

2.2 饲料中过量添加蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆鱼体常规组成的影响

如表3所示，饲料中过量添加晶体蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆鱼体蛋白、脂肪、灰分、水分组成没有显著性影响（P＞0.05）。但随着晶体蛋氨酸和HMTBA添加量的增加，鱼体蛋白和脂肪含量均有下降的趋势，而灰分和水分含量有上升的趋势。处理6组鱼体粗蛋白含量最低，与处理1和处理2组有显著差异（P＜0.05），与处理3、处理4和处理5组无显著差异。

表3 不同实验饲料对大菱鲆鱼体常规组成的影响Table 3 Final carcass composition of turbot fed different experimental diets

表4 不同实验饲料对大菱鲆鱼体肥满度、脏体比和肝体比的影响Table 4 Condition factor（CF），visceral indexes（VSI）and hepatosomatic indexes（HSI）of turbot fed different experimental diets

2.3 饲料中过量添加蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆形体指标的影响

如表4所示，饲料中过量添加晶体蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆肥满度（CF）、脏体比（VSI）和肝体比（HSI）等形体指标没有显著性影响（P＞0.05），但大菱鲆VSI和HSI随蛋氨酸添加量的增加（处理1、处理2和处理3）和HMTBA添加量的增加（处理1、处理4和处理5）均有下降的趋势。

2.4 饲料中过量添加蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆肝脏抗氧化反应的影响

如表5所示，饲料中过量添加晶体蛋氨酸和HMTBA对肝脏过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和硫代巴比妥酸反应产物值（TBARS）没有显著影响（P＞0.05），在处理3组大菱鲆肝脏CAT活力和TBARS值最低。

表5 不同实验饲料对大菱鲆肝脏抗氧化反应的影响Table 5 Antioxidant responses in liver of turbot fed different experimental diets

3 讨论

3.1 饲料中过量添加蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆存活和生长性能的影响

大量研究表明，当饲料中蛋氨酸含量在一定程度上超过其最适需求量后，有些鱼类生长相对稳定，没有受到显著的影响［17，33－35］，但也有些鱼类生长显著下降［18，40］。朱旺明等［41］对欧洲鳗（Anguilla anguilla）的研究表明当蛋氨酸水平高于正常需要量（最适量的1.24倍）时，增重和SGR显著降低；Ahmed等［42］对印度鲤鱼（Cirrhinus mrigala）的研究表明，与饲料蛋氨酸水平为1%组相比较，当蛋氨酸水平为2%（最适量的1.67倍）时，印度鲤鱼的增重、SGR、饲料系数和PER有显著差异：增重降低了53.59%，SGR降低了42.21%，饲料系数增加了118.62%，PER降低了54.19%。Zhou等［43］对军曹鱼（Rachycentron canadum）的研究表明当饲料蛋氨酸含量从1.05%增加到1.68%（最适量的1.41倍）时，增重降低了32.50%，SGR降低了16.30%，饲料系数提高了52.04%，PER降低了35%。而Twibell等［12］对黄鲈（Perca flavescens）的研究，Alam等［17］对牙鲆（Paralichthys olivaceus）的研究，Luo等［19］对斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）的研究均表明饲料中过量添加晶体蛋氨酸（最适量的1.36～1.61倍）对实验动物的生长和饲料利用没有显著影响。出现上述现象的一个重要的原因可能是不同鱼类对饲料中过量蛋氨酸（最适量的1.24～1.67倍）的耐受量不同。本研究结果表明随着饲料中晶体蛋氨酸的过量添加（1.31～1.73倍），大菱鲆的存活率、SGR、PER和PPV没有受到显著影响，但有下降的趋势，这和对牙鲆和斜带石斑鱼的研究所得结果一致。

过量添加HMTBA组（处理4和处理5）大菱鲆与基础饲料组相比，存活和生长指标均无显著差异。与基础饲料组相比，处理3组和处理5组造成大菱鲆增重下降的幅度分别为11.86%和5.67%；SGR的下降幅度分别为7.08%和3.64%。可见在相同的养殖环境中，饲料中过量蛋氨酸羟基类似物（1.32～1.75倍）对大菱鲆造成的负面影响略低于过量晶体蛋氨酸。

3.2 饲料中过量添加蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆鱼体组成和形体指标的影响

关于饲料中过量蛋氨酸对鱼体组成和形体指标的影响，报道不一致。欧洲鳗饲料蛋氨酸过量，体脂肪含量显著降低，体蛋白和灰分含量不受影响［41］；印度鲤鱼饲料中蛋氨酸过量，体蛋白含量显著降低，体脂肪和灰分不受影响［42］；北极红点鲑饲料中过量添加蛋氨酸对鱼体粗蛋白、脂肪、灰分和水分无显著性影响［15］；牙鲆饲料过量添加蛋氨酸对鱼体粗蛋白、脂肪、灰分和水分无显著性影响［17］；军曹鱼饲料过量添加蛋氨酸对鱼体成分、肥满度、脏体比和肝体比均无影响［43］；斜带石斑鱼饲料过量添加蛋氨酸对鱼体体蛋白、灰分、水分、肥满度和脏体比无影响，但显著影响鱼体体脂肪和肝体比［19］。本研究中过量添加晶体蛋氨酸和HMTBA对鱼体组成、肥满度、脏体比和肝体比无显著性影响，但鱼体体蛋白、体脂肪、脏体比和肝体比随蛋氨酸和HMTBA添加量的增加有下降的趋势，这可能是过量蛋氨酸的毒性导致的［44］。而向处理6组饲料中添加0.85%柠檬酸钙后，实验鱼体蛋白含量显著降低，这可能是饲料中过量的钙离子（1.38%）影响到钙镁离子间的平衡［20］，从而影响肝脏中蛋白质的合成。MHA中除了含有HMTBA以外，还含有12%的钙。有趣的是，本研究中过量添加MHA组（处理5，钙离子的含量为3.13%）对大菱鲆鱼体蛋白质含量没有显著影响。处理6（柠檬酸钙含量0.85%）中同样的过量钙离子（3.13%）却对鱼体蛋白质含量造成不同的影响结果，这可能与钙离子的存在形式有重要关系，具体原因有待于进一步研究。

3.3 饲料中过量添加蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆抗氧化反应的影响

硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）含量反映机体内自由基水平及脂质过氧化程度，而过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的变化反映了机体自由基的清除能力［45］。当机体发生氧化损伤时，脂质过氧化物水平往往升高，而抗氧化酶活性降低。本研究中，与基础饲料组相比，过量添加晶体蛋氨酸和HMTBA组中肝脏CAT、SOD活力和TBARS值均无显著性差异，可见饲料中过量的晶体蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆肝脏抗氧化反应未造成显著影响。

由以上实验结果可知：饲料中一定程度过量添加晶体蛋氨酸（1.31～1.73倍）及蛋氨酸羟基类似物（1.32～1.75倍）对大菱鲆幼鱼生长、饲料利用和抗氧化反应无显著性影响。在本实验条件下，大菱鲆对过量蛋氨酸有较高的耐受性，对蛋氨酸羟基类似物的耐受性要略高于晶体蛋氨酸，这为进一步的蛋氨酸羟基类似物安全性实验的设计提供了依据。

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The Influence of Overdose Dietary DL－Methionine or HMTBA on Growth，Feed Utilization and Anti－Oxidant Responses of Turbot（Scophthalmus maximus L.）

HOU Hua－Peng，MA Rui，ZHANG Wen－Bing，MAI Kang－Sen
（The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

A growth experiment was conducted to evaluate the influence of overdose dietary DL－methionine（Met）or 2－Hydroxy－4－（Methylthio）butanoic acid（HMTBA）on turbot（initial body weight：（5.49±0.01）g）.The control contained 1.35%Met and 0.22%HMTBA.Five different doses of Met or HMTBA were added to the basal diet，respectively.Finally，6 experimental diets were formulated，and the analyzed levels of Met or HMTBA in diets are as follows：Met：1.35%，1.83%，2.50%，1.45%，1.37%，2.51%；HMTBA：0.22%，0.22%，0.22%，0.63%，1.38%and 0.29%.Each diet was fed to five replicate groups of turbot for 10 weeks.Results showed that no significant differences in growth responses were found among dietary treatments（P＞0.05）.No significant difference was observed in body composition，condition factor（CF），visceral indexes（VSI），and hepatosomatic indexes（HSI）（P＞0.05），but the content of body protein of fish in treatment of diet 6 was significantly lower than those in the control and diet 2（P＜0.05）.No significant differences in hepatic catalase activity，superoxide dismutase activity，thiobar－bituric acid reactive substances value were found in liver（P＞0.05）.In conclusion，overdose dietary DL－Met（1.31～1.73 times）or HMTBA（1.32～1.75 times）had no significant effects on growth，feed utilization and anti－oxidant responses in turbot under the current experimental conditions.

Turbot；DL－methionine；HMTBA；growth；anti－oxidation

S963

A

1672－5174（2012）03－036－08

国家自然科学基金项目（31072219）资助

2011－06－09；

2011－09－25

侯华鹏（1988－），女，硕士生。E－mail：hhphaida＠163.com

＊＊通讯作者：E－mail：wzhang＠ouc.edu.cn

责任编辑 王 莉