重组人干扰素α－2b－卡介苗（hIFN－α－2b－BCG）药物敏感性分析

李 娜，牛瑞芳，韩瑞发，孙二琳

（1.天津医科大学 肿瘤医院，天津 300060；2.天津医科大学第二医院 天津泌尿外科研究所，天津 300211）

重组人干扰素α－2b－卡介苗（hIFN－α－2b－BCG）药物敏感性分析

李 娜1，牛瑞芳1，韩瑞发2，孙二琳2

（1.天津医科大学 肿瘤医院，天津 300060；2.天津医科大学第二医院 天津泌尿外科研究所，天津 300211）

通过BACTEC MGITTM 960全自动分枝杆菌培养鉴定／药敏仪对重组人干扰素α－2b－卡介苗（hIFN－α－2b－BCG）菌株进行利福平等10种抗菌药物的敏感性试验，以野生BCG作对照观察药物对重组BCG菌株活性的潜在影响.结果发现：重组人干扰素α－2b－卡介苗在系统感染上对喹酮类的氧氟沙星、环丙沙星敏感，对氨基糖苷类药物的庆大霉素和卡那霉素耐药.在抗结核类药物中，除对吡嗪酰胺耐药外，对利福平等其他几种抗生素均敏感.因尿液回收率高，几乎所有的抗菌药物都对膀胱中的菌株有影响.

膀胱肿瘤；重组BCG；人干扰素α－2b；免疫反应；耐药性

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，非肌层浸润性肿瘤占75%，其中95%为高危尿路上皮癌，单纯手术切除的近期复发率为60%～90%，远期复发率近100%.野生型卡介苗（BCG）膀胱腔内灌注是膀胱肿瘤最有效的生物治疗方法之一.近年来，干扰素α（IFN－α）作为二线药物用于膀胱灌注治疗肿瘤，对部分BCG无反应的患者有效，且局部和全身毒性小.但作者在BCG膀胱灌注治疗中发现，病人治疗中可出现严重并发症，也可引起威胁生命的BCG播散感染，即BCG炎症或BCG病.病例分析表明BCG感染的并发症主要有以下2种：（1）局部并发症：BCG引起的类似膀胱炎症的局部反应，如尿急、尿频、尿痛、血尿等.原因：BCG是一种监督活疫苗，灌注膀胱后引起膀胱黏膜局部炎症及暂时性的全身感染.（2）全身并发症：BCG进入血液循环引起全身并发症，如高热、肉芽肿样改变、脓毒血症、肺炎等.原因：膀胱肿瘤瘤体切除后，其黏膜下层及肌层很快形成血管丰富的肉芽组织，在黏膜尚未修复前，BCG容易通过这些肉芽肿组织进入血液循环而致一系列全身反应.临床常使用一些抗菌药物来减轻并治疗该副作用.由于抗生素使用的广泛性，它们是否可以治疗患者膀胱灌注后的不良反应并影响BCG的活性，从而影响其抑制膀胱肿瘤的效果还有待探讨.这些问题成为本研究的主旨.

多年临床观察和动物实验研究证实：BCG菌株的活性是抑制膀胱肿瘤复发的关键因素.随着BCG抗肿瘤作用机制的深入研究，有学者认为BCG是治疗膀胱肿瘤最为有效的免疫制剂，明显优于化学疗法.近来临床上出现了多种联合免疫治疗方法，其中BCG联合INF－α－2b被认为是最行之有效的治疗手段［1］.刘春雨等［2］先期采用现代基因工程技 术 构 建 了 重 组 人IFN－α－2b－BCG （hIFN－α－2b－BCG），将其用于浅表性膀胱肿瘤复发的预防和免疫治疗.重组BCG作为一种减毒的结核杆菌，被灌入膀胱后可引起炎症反应并释放细胞因子，通过免疫反应破坏肿瘤细胞并防止肿瘤复发，因此BCG治疗的关键在于其菌株的活性［3－5］.

孙二 琳 等［6－7］对 重组 hIFN－α－2B－BCG 的 生 物学特性和小鼠原位膀胱肿瘤免疫效应进行了研究.本研究以野生BCG菌株作对照，进行重组IFN－α－2b－BCG的药敏试验，以探讨某些抗菌药物在有效减轻重组BCG灌注副作用的同时对重组IFN－2b－BCG活性的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

2株丹麦野生型BCG购自北京生物制品研究所；2株重组hlFN－α－2b－BCG为天津泌尿外科研究所构建并保存；Middlebrook 7H9购自美国sigma公司；BACTEC MGIT TM 960全自动分枝杆菌培养、鉴定／药敏仪为美国JOHSTON实验公司仪器；药敏实验药品利福平、异烟肼乙胺丁醇、对氨基水杨酸钠、丁胺卡那、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氧氟沙星、环丙沙星等10种药物均购自天津药物研究所.

1.2 方法

1.2.1 野生BCG和重组hlFN－α－2b－BCG的培养

将2种BCG菌株接种于Middlebrook 7H9液体培养基中，37℃摇床中震荡培养，细菌进入对数生长期后用培养液调整其浓度为1g／L.进行以下实验.

1.2.2 药敏实验药品制备

由蒸馏水或DMSO稀释药物至500、250、100、10、4、2、0.5、0.25、0.1ug／mL，以获得精确的MIC.

1.2.3 抗菌素敏感性检测

使用BACTEC MGIT TM 960系统检测方法.将Middlebrook 7H9液体培养基中的菌株接种于BACTEC MGIT TM 960系统内已加药的快速培养管中.37℃培养1周.BACTEC MGIT TM 960全自动分枝杆菌培养鉴定／药敏仪系统采用连续荧光检测技术，配套使用MGIT快速培养管，底部包埋有荧光显示剂，直接感应培养管内氧气浓度.当培养管内有分枝杆菌生长时，氧气被消耗，荧光显示剂在特定光源的激发下发生荧光，BACTEC MGIT荧光强度记忆探测器每隔60min连续测定培养管内荧光强度，并通过数据处理得出阳性结果，以生长单位（GU，Growth Unit）形式报告.

2 结果与讨论

本研究中检测了对结核杆菌有抑制或杀灭作用的10种药物，分属于经典抗结核类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类3类药物，其对重组hIFN－α－2b－BCG（以下简称重组BCG）和野生BCG的药敏实验结果见表1.当药物的最小抑菌浓度不超过标准剂量血药质量浓度的25%时，假设2种BCG菌株系统敏感；当药物的最小抑菌浓度低于尿药质量浓度的25%时，假设2种BCG菌株局部敏感.

从实验结果来看，重组BCG对喹酮类的氧氟沙星、环丙沙星敏感，对氨基糖苷类药物的庆大霉素和卡那霉素耐药；在抗结核类药物中，除对吡嗪酰胺耐药外，对利福平等其他几种抗生素均敏感；而作为对照的野生BCG除对吡嗪酰胺耐药、对庆大霉素系统耐药外，对其他8种药物均敏感.

有研究表明：短期使用异烟肼（INF）不会降低免疫治疗的疗效，长期使用会降低重组BCG抗肿瘤的作用［6］.

表1 重组BCG和野生BCG药敏实验结果Tab.1 Results of recombinant hIFN－α－2bBCG susceptibility testing，control with wild BCG

作者试图减少抗菌药物对BCG的影响.在系统感染中，BCG的敏感性是由血药浓度决定的.从实验结果来看，一些抗菌药物在血药水平上影响BCG的活性.氨基糖甙类药物中，血药浓度上除庆大霉素、卡那霉素对重组BCG影响较小外，丁胺卡那、链霉素均对重组BCG活性有影响.在局部感染中，BCG对药物的敏感性由尿药浓度决定.由于被测药物的MIC很少能达到最大尿药浓度的25%，所以重组和野生BCG对除吡嗪酰胺外的9种药物均敏感，9种药物均可影响重组和野生BCG活性.

在众多抗菌药物中，氟喹诺酮类药物有很好的耐受性，抗菌范围较宽并可迅速被组织吸收.如果灌注治疗过程早期出现如持续发热或附睾炎等，使用非特异性的抗生素类药物，如氟喹诺酮类，可有效减少并发症的发生.少数情况下，如果患者对这种非特异性的药物治疗不敏感，应考虑3种药物（异烟肼，乙胺丁醇和利福平）联合使用，同时使用类固醇控制过敏反应［8］，但不排除联合使用该类药物可能会使BCG抗肿瘤作用丧失［9］.因此，在重组BCG对患者没有造成严重影响的情况下，建议使用不影响BCG活性的药物，临床治疗时可依据病人的实际情况，合理使用有效的药物.

［1］ LAM J S，BENSON M C，O'DONNELL M A，et al.Bacillus CALMETE－Guerin plus interferon－alpha 2Bintravesical thera－py maintain an extended treatment plan for superficial bladder cancer with minimal toxicity［J］.Urol Oncol，2003，21（5）：354－360.

［2］ 刘春雨，韩瑞发.PhlFN－α－2B穿梭质粒在卡介苗中的表达［J］.中华泌尿外科杂志，2006，27：12－15.

［3］ BARTLETT G L，KREIDER J W，PURNELL D M，et al.Augmentation of immunity to line 10hepatoma by BCG：Comparison of different BCG preparations［J］.Cancer，1980，46：488－496.

［4］ AKAZA H，IWASAKI A，OHTANI M，et al.Expression of antitumor response：Role of attachment and viability of bacillus Calmette－Guérin to bladder cancer cells［J］.Cancer，1993，72：558－563.

［5］ BROSMAN S A.Bacillus Calmette－Guérin immunotherapy：Techniques and results［J］.Urol Clin N Am，1992，19：557－564.

［6］ 孙二琳，范晓东，王玉叶，等.重组hIFN－α－2B－BCG的生物学特性的观察［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2010，30（1）：46－50.

［7］ 孙二琳，范晓东，王玉叶，等.重组hIFN－α－2b－BCG对小鼠原位膀胱肿瘤免疫效应的研究［J］.中华泌尿外科杂志，2011，32（01）：38－41.

［8］ De BOER E C，STEERENBERG P A，VAN der MEIJDEN A P M，et al.Impaired immune response by isoniazid treatment during intravesical BCG administration in the guinea pig［J］.J Urol，1992，148：1577－1582.

［9］ LAMM D L.Complications of bacillus Calmette－Guérin immunotherapy［J］.Urol Clin North Am，1992，19（3）：565－572.

Analysis on drug sensitivity tests of recombinant hIFN－α－2bBCG

LINa1，NIURui－fang1，HANRui－fa2，SUNEr－lin2
（1.Tumour Hosptial of Tianjin Medical University，Tianjin 300060，China；
2.Tianjin Institute of Urological Surgery，The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

To understand the situation of drug resistance of hIFN－α－2bBCG，in order to explore the curative effects of antibiotics on adverse reaction caused by IFN－α－2b－BCG during treating bladder carcinoma and their impact on anti－tumor effect of recombinant IFN－α－2b－BCG，wild BCG served as control，10kinds of antibacterial drugs including rifampicin，potentially effective against the IFN－α－2b－BCG，were measured in vitro by the BACTEC 960TB method，to observe the potential impact of antibiotics on the activity of recombinant BCG strains.The results showed that IFN－α－2b－BCG was susceptible to quinolones in systemic infections but resistant to some aminoglycosides.It was resistant to pyrazinamide but showed good susceptibility toward the other antituberculosis drugs tested.Most antibacterials may interfere with IFN－α－2b－BCG in the bladder because of high urinary recovery.

urinary bladder neoplasms；recombinant BCG vaccine；IFN－α－2b；immunotherapy；drugresistance

R759.2

A

1671－1114（2012）03－0075－03

2011－12－14

国家自然科学基金（30872587）；天津卫生局重点攻关项目（11KJ147）；天津市科技支撑计划重大项目（07ZCKFSH03200）；国家科技部“十一五”重大专项新药创建课题（2009ZX09103－699）

李 娜（1983—），女，初级检验师，主要从事肿瘤分子免疫方面的研究.

牛瑞芳（1965—），女，教授，主要从事生化分子生物学方面的研究.

（责任编校 纪翠荣）