超高效液相-串联质谱快速检测牛奶中阿维菌素类毒素残留

杨绍谊，崔涛，赵源，张雪峰，常建军

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司分析中心，呼和浩特 011500）

超高效液相-串联质谱快速检测牛奶中阿维菌素类毒素残留

杨绍谊，崔涛，赵源，张雪峰，常建军

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司分析中心，呼和浩特 011500）

将样品经乙腈提取，利用碱性氧化铝萃取小柱净化，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C8（50 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）；柱温为30℃；流速设为0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相为乙腈水按梯度洗脱。质谱在电喷雾负离子模式下，对阿维菌素类药品进行多反应离子监测。结果阿维菌素类药残平均回收率为62.0%～95.0%，精密度的相对标准偏差（RSD）为4.32%；最低检出限（LOD）为1.0 μg/L。该方法快速准确，灵敏度高，是检测牛奶中阿维菌素类药品残留可借鉴的分析方法。

阿维菌素类；超高效液相色谱；电喷雾串联质谱；固相萃取

0 引 言

Avermectins是由链霉素产生的一组大环内酯类物质，包含结构相似的8种组分。该类化合物对线虫和节肢动物有极强的驱杀作用，从而使抗蠕虫药物用药剂量由mg/kg级下降到ug/kg级。目前在这类药物中已商品化的有阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、依普菌素。伊维菌素是阿维菌素由加氢还原获得[1]。这类药物是目前兽医临床上用量最大的抗寄生虫药，对各种寄生线型动物和节肢动物具有很强的抑杀作用，其效果比常用农药高5～50倍，还有药效持久的特点。其作用机理是干扰害虫神经生理活动，刺激释放r-氨基丁酸，作用于神经与肌肉接头，增加氯离子的释放，抑制神经接头的信息传递，致使害虫出现麻痹而中毒死亡。美国、欧盟、日本和中国等均制定了阿维菌素类药物的最高残留限量[2-3]。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Waters UPLC分离单元，配有自动进样器，Waters TQD质谱检测器，配有电喷雾电离源（ESI）；分析天平；Heal Force高速冷冻离心机；Organomation N-EVAP氮吹仪；

阿维菌素（Dr.Ehrenstorfer纯度95.0%）；伊维菌素（Dr.Ehrenstorfer纯度96.0%）；多拉菌素（Dr.Ehrenstorfer纯度96.0%）；伊谱菌素（Dr.Ehrenstorfer纯度96.0%）Millipore超纯水系统；Waters Sep-Pak碱性氧化铝萃取小柱。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱（50 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）； 柱温30℃； 流速0.30 mL/min；进样体积10 μL；流动相为A（乙腈）∶B（水）。

表1 色谱分离梯度

1.3 质谱条件

电离方式为ESI（－），电离电压为3.00 kV，锥孔电压为50 V；源温度为120℃，去溶剂气温度为350℃，去溶剂气流量为700 L/h，锥孔气流量为50 L/h，采集方式为多反应监测（MRM）。阿维菌素类毒素质谱条件参数如表2所示。

表2 阿维菌素类质谱参数

1.4 样品处理

称取牛奶样品2.00 g于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋1 min，放入超声机中超声10 min，在5 000 r/min下离心10 min，取上清液转移到碱性氧化铝固相小柱上（用3 mL乙腈活化），净化液收集于10 mL玻璃试管中，然后用氮气45℃吹干，用1 mL的70%乙腈水溶解，涡旋2 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤后用于UPLC-MS/MS分析[4]。

1.5 流动相的选择

实验过程中分别选用了乙腈和10 mmol乙酸铵溶液，乙酸铵溶液用氨水调节到pH9.0左右；甲醇和10 mmol乙酸铵溶液；乙腈和水；甲醇和水作为流动相，同时对10 ng/mL的伊维菌素测定液进行测定以及通过Waters ACQUITY UPLC BEH C8（50 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）色谱柱观察了它们以按表1中色谱梯度比例混合时阿维菌素类标准品的分离效果。结果如图1、图2所示，有机相的比较中，乙腈的使用有着较高的灵敏度；缓冲液的比较中，一定浓度的乙酸铵可以有利于阿维菌素类农药的色谱峰形，但在测定中，乙酸铵的使用对阿维菌素类农药的灵敏度响应与纯水的相差不大，出于对实验简便性的考虑，本实验选用了乙腈和纯水作为流动相。

1.6 色谱柱的选择

实验过程中分别选用了Waters ACQUITY UPLC BEH C8（10 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC（50 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）4种不同类型的色谱柱，在同一流动相条件下，对比20 ng/mL浓度的伊维菌素标准品溶液在4种色谱柱中的灵敏度，出峰时间及峰型，BEH C8色谱柱与其它类型的色谱柱相比，具有灵敏度高，出峰时间快，峰型好的特点，在实验中选用了Waters ACQUITY UPLC BEH C8（10 mm×2.1 mm I.D，1.7 μm）进行色谱分离，如图3。

1.7 方法的线性范围与检出限、定量限

1.7.1 标准曲线的制作

将质量浓度分别为10，20，40，60，80，100 μg/L阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和伊谱菌素混合标准系列，依次进样，进样量10 μL。各混合标准液均用基质提取液配制，基质提取液是选用空白样品，同1.4操作，收集得到的净化液不经氮气吹干，直接用于配制标准品，以消除基质干扰。分别制作阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和伊谱菌素的10～100 μg/L 4条标准曲线，其相关系数及回归方程如表3所示。

表3 线性范围、回归方程和相关系数

1.7.2 检出限和定量限

测定阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和伊谱菌素的最低检出限均为1.0 ng/mL，它们的定量限为2.0 ng/mL。测定结果如图4所示。

1.8 方法的回收率与精密度

1.8.1 回收率实验

取不含有阿维菌素类牛奶为试验样品，分别配制成2，5，10 μg/L 3个质量浓度的阿维菌素类标准品加标样品，按1.4样品前处理方法进行处理，并上机进行测定，结果如表4所示。

表4 方法回收率

1.8.2 精密度实验

以5.0 μg/L质量浓度的伊维菌素标准品加标样品作为待测样品，重复取样10次，按1.4样品前处理方法进行处理，并上机进行测定。伊维菌素的质量浓度依次为4.1，4.3，4.6，4.5，4.7，4.2，4.4，4.3，4.2，4.4 μg/L，其相对标准偏差为4.32%。

2 结束语

本文建立了使用UPLC-TQD同时检测牛奶中阿维菌素类药物残留的方法，以增强检测的准确性，并针对牛奶产品，采用适宜的提取和前处理方法。该方法快速准确，灵敏度高，有效的抑制了基质对检测目标物的干扰，最低检出限（LOD）是1.0 μg/L，是检测牛奶中阿维菌素类药物残留量可借鉴的分析方法。

[1]CAMPBELL W C.Ivermectin and abamectin[M].New York：Springer-Verlag New York Inc.1989.

[2]DAVID N H,FRANK J.Particle Beam Liquid Chromatography/Mass Spectrometry with Negative Ion Chemical Ionization for the Confirmation of Ivermectin Residue in Bovine Milk and Liver[J].Schenck,Biological Mass Spectrometry,1993,22（3）：184-193.

[3]DAVID A.DURDEN.Positive and Negative Electrospray LC-MSMS Methods for Quantitation of the Antiparasitic Endectocide Drugs,Abamectin,Doramectin,Emamectin,Eprinomectin,Ivermectin,Moxidectin and Selamectin in Milk[J].Journal of Chromatography B,2007,850（1-2,）：134-146.

[4]SHER M.Simultaneous Determination of Eprinomectin,Moxidectin,Abamectin,Doramectin,and Ivermectin in Beef Liver by LC with Fluorescence Detection[J].Journal of AOAC International,2000,83（1）：31-38.

Determination of avermectins in milk by ultra performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry

YANG Shao-yi，CUI Tao，ZHAO Yuan，ZHANG Xue-feng，CHANG Jang-jun
（Inner Mongolia Meng Niu Dairy Industry（Group）Co.Ltd Analysis Center,Huhhot 011500,China）

Sample was extracted with acetonitrile,purified by basic alumina cartridge.Liquid chromatographic separation was carried out on a Waters ACQUITY UPLC BEH C8column（50mm×2.1mm I.D，1.7 μm）；with column temperature 30℃；flow rate 0.3 mL/min,injection volume 10 μL and acetonitrile/water as the mobile phase.In the negative ion mode of ESI-MS,recorded in the MRM.The average recoveries ranged from 62.0%～95.0%and the relative standard deviation（RSD）was 4.32%.The limit of detection（LOD）was 1.0 μg/L.The present method is quick,accurate and sensitive.It is suitable for analysis of Avermectins residues in milk.

Avermectins；UPLC；ESI-MS/MS；SPE

TS252.7

A

1001-2230（2012）08-0047-03

2011-07-01

杨绍谊（1981-），男，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。