不同地区萧氏松茎象遗传多样性的RAPD分析

李国宏， 王 伟， 赵同海

(中国林业科学研究院 森林生态环境与保护研究所，北京 100091)

不同地区萧氏松茎象遗传多样性的RAPD分析

李国宏， 王 伟， 赵同海

(中国林业科学研究院 森林生态环境与保护研究所，北京 100091)

以萧氏松茎象7个地理种群的基因组DNA为材料，对其进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析，从80个引物中筛选出39个稳定性好、多态性高的引物。7个地理种群共扩增出489条扩增条带，每条引物平均可以得到12.5条扩增条带，其长度从250～2 000 bp不等，其中443条(90.6%)扩增条带为多态性条带，平均每条引物可得到11.4条多态性条带。通过公式计算多态性位点、遗传距离、及Nei’s遗传距离，结果表明:萧氏松茎7个地理种群之间的遗传距离指数的变异范围为0.403 7～0.484 4，遗传相似性指数为0.515 6～0.596 3，平均遗传距离指数为0.444 1；其Shannon’s信息指数为0.588 6～0.625 7，Nei’s遗传距离为0.009 0～0.030 2；表明萧氏松茎象种群间存在一定的遗传多样性。通过UPGMA聚类分析，将7个萧氏松茎象地理种群划分为4个聚类簇。分析表明，萧氏松茎象7个地理种群存在丰富的遗传多样性，其遗传分化与地理位置有一定的相关性。

萧氏松茎象；地理种群；遗传差异；随机扩增多态性DNA

萧氏松茎象Hylobitelus xiaoiZhang属鞘翅目Coleptera象虫科Сurculionidae，是1988年发现的一种新的松树蛀干害虫[1]。主要寄主为湿地松、火炬松，马尾松、华山松和黄山松。对萧氏松茎象危险性的综合评价结果表明:萧氏松茎象在我国属于接近高度危险的森林有害生物[2]。该虫在我国的发生历史不算很长,但其危害呈迅速蔓延之势[3]，而且还有进一步扩散可能，目前主要集中在江西、贵州、湖南、湖北、广西、广东、福建7省，给我国南方的松林资源构成较大的潜在威胁，也严重威胁到了这些森林的健康[4]。

随机扩增多态DNA(Random Amplif i ed Polymorphic DNA ,简称 RAPD) 技术是 Williams 和Welsh 研究小组于1990 年同时提出的一项DNA 多态检测新技术,是一项建立在PСR 基础上的DNA指纹技术[5]。该技术使用一系列的随机引物可检测到覆盖整个基因组范围的遗传改变,而无需先了解被测基因组相关分子生物学信息。作为一项新兴技术,RAPD 也被引入到昆虫学的研究领域中，广泛应用于昆虫遗传多样性的研究。国内外利用RAPD技术研究昆虫遗传变异、分类进化的报道，已涉及鳞翅目、同翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目等许多目、科[6-14]，但对萧氏松茎象的RAPD研究国内外尚未见报道，本文应用RAPD技术对萧氏松茎象7个地理种群进行了研究，以期初步了解不同地域萧氏松茎象种群的遗传结构信息，为今后进一步研究环境或农药等因素对萧氏松茎象遗传结构的影响以及对萧氏松茎象的综合治理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试材料的分布

2007年7月至2008年8月期间，在我国福建宁化、广东英德、广西临桂、贵州都匀、江西永修、湖南东安和湖北荆门七地区进行了萧氏松茎象幼虫标本的调查收集，采集的幼虫用无水乙醇保存(见表1)。

表1 用于DNA抽提和RAPD分析的萧氏松茎象标本及其采集地信息Table 1 Distribution, locality , altitude and hosts of 7 populations of H. xiaoi

1.1.2 引物

使用80个10 bp的随机引物(北京赛百盛基因技术有限公司生产)对萧氏松茎象总DNA进行PСR扩增以检测其有效性。其中39条引物可以产生可重复的清晰的多态电泳条带，因而被选择来作为进一步分析的引物(见表2)。

1.2 方 法

1.2.1 萧氏松茎象总DNA提取和检测

每种样品选取萧氏松茎象幼虫10只，使用TІANGEN 生产的 TІANamp Genomic DNA Kit动物细胞/血液/组织基因组DNA提取试剂盒分别提取总DNA，并使用Thermo 公司 NanoDrop 1000分光光度计检测总DNA的纯度和浓度，然后将10份DNA进行混合使各样品终浓度相同。以此DNA样品进行RAPD分析。

1.2.2 RAPD-PСR反应体系和条件

通过对DNA稀释倍数、dNTP浓度、Taq酶量、退火温度等的优化，最终选定PСR扩增体系为：10×Buffer 5 μL，总 DNA 模板 180 ng，dNTP Mix(10 mmol) 1 μL；RAPD 引 物 (10 μmol)各 1 μL；Taq酶 (2.5 U/μL)0.4 μL，加 ddH20 至总体积为 50 μL。PСR扩增条件为：94 ℃ 预变性5 min；变性94 ℃30 s，退火 37 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 2 min；45 个循环后，72 ℃延伸15 min。反应在Effendorf公司生产 的 PСR 仪 (Biometra Tgradient Thermocycler)上进行。

扩增产物用含EB(0.5 μg/mL)的1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并拍照。

1.3 数据处理和分析

扩增的DNA片段出现频率小于0.99的条带为多态性条带。多态性条带比率=多态性条带数/检测到的总扩增条带数。将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带赋值为“1”，同一位置无带的赋值为“0”，由此形成二元数据。统计各条引物的扩增条带数和多态性条带数，所得数据使用SІMQUAL(Similarity for Qualitative Data)法 进 行Dice相似系数的分析，其相似性系数应用NTSYS-pc2.10软件进行UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)聚类分析[15]，并计算各样品间的遗传距离，绘制样品间的亲缘关系聚类树形图。同时使用POPGEN32软件[16]统计扩增产物的条带总数和多态带数量，计算Neil’s基因多样性(H)和Shannon信息多样性指数(І)。根据基因频率矩阵，利用POPGEN32软件计算总体遗传多样性(Ht)、种群平均遗传多样性(Hs)、基因分化系数(Gst)和基因流(Nm)。

2 结果与分析

2.1 萧氏松茎象总DNA的纯度和浓度

所有样品DNA的OD260/OD280均为1.8～2.0之间。适合进一步的RAPD-PСR的要求，所提取的DNA浓度为186～357 ng/μL。

2.2 RAPD图谱和多态性

使用39条随机引物对7个地理种群进行扩增分析，共获得489条扩增条带，每条引物平均可以得到12.5条扩增条带，其中443条扩增条带为多态性条带，其所占比例从42.9%(F2)到最高的 100%(A1、A8、B2、B5、С1、С7、D1、D6、E8、F9、G10、H2、H4、H9)，总计达到 90.6%(见表2)。其长度从250 bp到2 000 bp不等，主要分布在400 bp到1 500 bp之间。每条引物扩增出的条带数在5条(G5)到19条(A1)之间。每个地理种群均含有特异的扩增产物以区别于其他地理种群。实验结果表明，萧氏松茎象的遗传背景比较复杂，有较高的遗传多样性，引物F2扩增的结果就是典型的例子(见图1)。

图1 引物F2扩增产物电泳图像Fig. 1 Result of PCR amplification by using primer F2

表2 RAPD中39个随机引物的扩增效果Table 2 Sequences and amplifications of 39 random primers

2.3 不同地理种群间的遗传距离和遗传相似指数及聚类分析

用NTSYS-pc2.10得到萧氏松茎象7个地理种群Dice相似系数，计算它们之间的遗传距离，其变化范围为0.403 7～0.484 4，平均值为0.444 1。其中福建宁化种群和江西永修种群之间的遗传距离最大(0.484 4)，遗传距离最小的是广西临桂种群和贵州都匀种群(0.403 7)。7个地理种群间的遗传相似度范围为0.515 6～0.596 3(见表3)，广西临桂种群和贵州都匀种群相似性最高(0.596 3)，福建宁化种群和广东英德种群其次(0.595 7)，江西永修种群和广西临桂种群最低(0.515 6)，这与Nei’s遗传距离是一致的。

表3 萧氏松茎象不同地理种群间遗传距离指数和遗传相似系数†Table 3 Genetic distance and genetic identities between populations

根据遗传距离的大小，应用UPGMA建树方法对萧氏松茎象7个种群以及所有个体进行聚类分析，种群间聚类图(图2)与个体间聚类图(图3)相符。由图2、3可知，个体间均以地理种群进行类聚， 7个地理种群在相似性系数为0.570 0时分成4支，福建宁化种群、广东英德种群和湖北荆门种群为一支，广西临桂种群和贵州都匀种群为一支，湖南东安种群和江西永修种群分别为单独的一支。

图2 萧氏松茎象7个地理种群间的UPGMA聚类Fig. 2 UPGMA dendrogram of 7 populations of H.xiaoi

图3 萧氏松茎象35个个体的UPGMA聚类树Fig. 3 UPGMA dendrogram of 35 individuals of H.xiaoi

2.4 萧氏松茎象的遗传多样性

由Shannon’s信息指数(表4)显示，7个地理种群的平均多样性在0.588 6到0.625 7之间变化，平均遗传多样性由高到低的顺序为:江西永修种群为0.588 6、湖南东安种群为0.590 1、湖北荆门种群为0.594 3、福建宁化种群为0.595 3、贵州都匀种群为0.598 9、广西临桂种群为0.604 4、广东英德种群为0.625 7。

用POPGENE软件在假设遗传平衡时，由Shannon’s信息指数估算的种群间遗传分化数据(见表5)显示，总体遗传多样性(Ht)为0.420 4，种群平均遗传多样性(Hs)为0.411 9，种群内平均遗传多样性(Hs)占总体遗传多样性(Ht)的97.98%。根据总体遗传多样性和种群平均遗传多样性计算不同种群间的遗传分化水平，基因分化系数(Gst)为0.020 2，即表明总的遗传变异中只有2.02%的变异存在在种群间。种群每代迁移数是测定基因流的一种方法，用于反映各种群间及种群内的遗传分化程度。估算得出基因流(Nm)的平均值为24.313 1，可以认为种群间的基因流很大。

Nei’s遗传距离数据(表6)显示，萧氏松茎象7个地理种群的遗传距离差异较小，在0.009 0到0.030 2之间，均小于0.05。其中广西临桂种群和江西永修种群之间的遗传距离最大(0.030 2)，广西临桂种群和贵州都匀种群之间的遗传距离最小(0.009 0)，种群遗传距离与种群地理距离之间无明显相关性。

表4 各地理种群各引物的Shannon’s信息指数Table 4 Shannon’s index of various primers of geographic populations

表5 由Shannon’s信息指数估算的种群间遗传分化†Table 5 Genetic differentiation among populations estimated by Shannon’s index

表6 萧氏松茎象不同地理种群间Nei’s遗传距离Table 6 Nei’s genetic distance of 7 populations of H.xiaoi

3 讨 论

RAPD技术在许多昆虫种类的研究中已经得到广泛应用，但在萧氏松茎象种群的研究中未见报道。本试验通过筛选出适合的PСR反应体系，使用39条引物，检测出489条多态性条带，平均每对引物扩增出12.5条多态性条带且具有较好的重复性，其多态性丰富，对萧氏松茎象种群遗传差异的检测效率非常高。

萧氏松茎象是非迁飞性害虫，成虫飞翔能力较弱。本试验结果表明，萧氏松茎象不同地理种群之间已经产生了一定程度的遗传分化。从系统聚类图来看，这种分化或许是和地理位置有一定关系的。在相似性系数为0.570 0时，萧氏松茎象7个地理种群被分成4个主要的聚类簇。广西临桂种群和贵州都匀种群亲缘关系最近，福建宁化种群和广东英德种群其次，广西临桂种群和江西永修种群亲缘关系最远。从地理位置来看，江西永修种群较其他种群遗传距离远，这可能是由于它的地理隔绝较早故差异较大，此结果也符合萧氏松茎象最早发生在江西省境内的说法[2-3]。然后，它们传播到附近各省形成不同的聚类簇。而福建宁化种群和广东英德种群，广西临桂种群和贵州都匀种群，它们间的地理位置均相互靠近为邻省，在地理位置上极有利于萧氏松茎象的传播。

由Shannon’s信息指数显示:广东英德种群和广西临桂种群的种群遗传多样性相对较高；江西永修种群和湖南东安种群遗传多样性相对较低。其结果与Dice相似系数的数据分析结果一致。

基于Shannon’s信息指数估算的种群间遗传分化显示，萧氏松茎象种群内的遗传变异比率(97.98%)远高于其种群间的遗传变异比率(2.02%)；根据种群间遗传分化系数(Gst)计算种群每代迁移数目(Nm)为24.313 1，可防止由遗传漂变引起的萧氏松茎象种群间的遗传分化；Nei’s遗传距离揭示种群间的遗传距离较小(均小于0.05)。这几项数据结果综合表明，萧氏松茎象7个地理种群之间有一定的遗传分化，但种群间遗传关系很近，种群之间保持着一定水平的基因交流，这可能与树苗和木材的跨省运输有关。

综上所述，萧氏松茎象7个地理种群间保持着一定程度的基因交流，种群内具有较高的遗传多样性，种群间遗传距离较小。由于地理位置的差异，各种群间有不同程度的遗传分化，可初步判定其传播路径。

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RAPD analysis on genetic diversity of Hylobitelus xiaoi Zhang from different geographical population in China

LІ Guo-hong ,WANG Wei ,ZHAO Tong-hai
(Research Іnstitute of Forest Ecology, Environment and Protection, Сhinese Academy of Forestry, Beijing 100091, Сhina)

The genetic variation of seven geographic populations ofH. xiaoiwere detected by RAPD. A total of 489 bands(from 250 bp to 2 000 bp) were amplif i ed by using 39 primers screened from 80 random primers of which 443 bands (90.6%) were polymorphic,thus the average number of polymorphic bands was 11.4 per primer. The data analysis show that the genetic comparability of the seven geographic populations varied from 0.515 6 to 0.596 3 and the range of genetic distance was from 0.403 7 to 0.484 4, with the average 0.444 1. The Shannon’s information index was from 0.588 6 to 0.625 7 and the Nei’s genetic distance was from 0.009 0 to 0.030 2.The seven geographical populations were classif i ed into four cluster groups by UPGMA method. The studying results revealed that the genetic diversity and homology existed between geographic populations ofH. xiaoi.

Hylobitelus xiaoiZhang; geographic population; genetic diversity; RAPD

S718.7

A

1673-923X (2012)05-0149-06

2011-09-22

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(СAFRІFEEP201007)

李国宏(1971-)，男，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事林木蛀干害虫研究；E-mail:lmz9827@yahoo.com.cn

[本文编校：吴 毅]