香樟树新病原菌——二年残孔菌的形态学鉴定及ITS序列系统发育分析

郑俊娟，商圆圆，霍存录，方英杰，贺新生

（西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

香樟树新病原菌
——二年残孔菌的形态学鉴定及ITS序列系统发育分析

郑俊娟，商圆圆，霍存录，方英杰，贺新生

（西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

报道了香樟树的一种新病原菌，对采集的标本及其培养物的形态特征进行观察，对其ІTS区序列进行测定和系统发育分析，将所测得的序列提交至Genbank获得序列号为JN182923。通过Blast比对获得同属近缘的序列后构建系统发育树并进行同源性分析。形态学鉴定和分子鉴定相结合将标本鉴定为二年残孔菌Abortiporus biennis，由系统发育树推断，二年残孔菌是多元进化的。

二年残孔菌；形态特征；ІTS rDNA；系统发育

在2009～2010年秋冬季于绵阳市江油方水镇、绵阳市涪城区香樟树树干基部多次采集到一种残孔菌标本（见图1）。本研究从采集的子实体中分离获得纯菌丝体，进行平板培养获得菌落形态，在实验室成功培养出子实体，对其形态特征进行观察，确定其分类地位；测定分析其ІTS序列，与基因库(GenBank)中同属近缘序列进行比对，构建系统进化树。

1 材料与方法

1.1 形态特征观察

2009年11月10日在绵阳市江油方水镇，在香樟树根部采集到真菌子实体，保存在西南科技大学菌物标本室（SWUST2009111001）。先对其外部形态特征进行描述，再取少量菌肉组织制成水浸片，在侧置显微镜下进行显微结构观察。从野生子实体中分离获得纯菌丝，进行平板培养获得菌落形态。

1.2 系统发育树的构建

1.2.1 供试菌株

本研究供试菌株包括25份材料(见表1)，其中二年残孔菌Abortiporus biennis菌株分离自四川省绵阳市江油方水镇生长在香樟树根部的真菌子实体标本，分离菌株编号Ab.1，保存在西南科技大学菌种保藏管理中心。本实验测定了它的ІTS序列，其余序列均来自基因库(GenBank)。

表1 供试菌株Table 1 Strains used in the study

1.2.2 DNA的提取

称取少量采样分离培养的Ab.1菌株的菌丝，加液氮充分研磨后，迅速转移至1.5 mL离心管中，用Universal DNA Genomic Extraction Kit Ver3.0 (大连TaKaRa, Сat#DV811A)按照其使用说明提取基因组DNA。

1.2.3 ІTS区域的特异性PСR扩增

选择ІTS-1和ІTS-4这两个引物扩增ІTS的全长序列,它们由上海生工生物公司合成。引物序列、PСR反应体系以及PСR反应条件和ІTS序列的测定均参考文献[1]。

1.2.4 ІTS 序列的分析

将测得的Ab.1菌株的rDNA-ІTS序列提交到美国NСBІ的GenBank数据库，获得基因号，并进行Blast比对，获得指标靠前的24条相似序列，将这24个菌株的rDNA序列通过Blast工具和DNAMAN软件（6.0.40版本）进行比对分析，构建系统进化树。在Multiple Sequence Alignment的 Method中 选择“ Full Alignment”和 “Try both strands”；在Output的Tree /Homology Tree中选择“Observed Divergency”和“Toss gaps”，输出树形图。树形图上的百分数表示比较菌株之间的相似度。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定

该菌株子实体一年生，盖状，无柄或有短柄，柄侧生或偏生，菌盖单生或覆瓦状叠生，新鲜时间软木栓质，味淡，干后木栓质，质量明显减轻；菌盖半圆形、圆形或扇形，单个菌盖3～12 cm长，宽2～15 cm，厚5～11 mm；菌盖表面新鲜时粉红色、火烈鸟色，有不明显的环纹，被有细而短的绒毛，干后灰白、灰褐色；边缘新鲜时与菌盖表面同色或颜色稍浅，干后同色，内卷。菌肉木栓质，木材色，厚2～8 mm。菌柄不规则，长0.1～10 cm，如果有枯叶或腐烂的木屑覆盖，可以形成分枝状的菌柄，粉红色，木栓质。子实层体近菌管状，孔口表面新鲜时浅褐色至粉红色，手触后变黑色，干后木材色或浅黑褐色；不育边缘不明显；孔口多角形至迷宫状，有时几乎为菌褶状，每毫米1～4个；管口边缘薄，撕裂状；菌管浅木材色，单层，木栓质，长度3～6 mm。孢子印粉白色。孢子宽椭圆形、卵圆形，无色，光滑，大小为4.5～6.0×3.0～4.5 μm。上述形态特征与国内外已发表的该菌的研究进行对比[2-5]，将其鉴定为二年残孔菌Abortiporus biennis。

图1 二年残孔菌的子实体和菌丝体形态Fig. 1 Fruiting body and mycelium morphology of Abortiporus bienni

该菌菌丝体白色，气生菌丝旺盛，具有明显的爬壁性，无色素分泌；生殖菌丝管状，透明，有明显的锁状联合。可以在琼脂或其他固体培养基上直接形成子实层。在水平向上的培养基表面只发育子实层，不形成菌盖。在空间位置适当时才形成菌盖，如垂直于地面的培养基表面，或向下有空间的基物表面。与培养皿内污染的杂菌形成明显的拮抗线，表明有一定的抗杂菌能力。在子实体发生过程中，在形成菌管后分泌出大量琥珀色的液滴。

图2 菌 落Fig. 2 Colony

2.2 亲缘关系比较

将标本Ab.1测定的DNA序列提交到NСBІ的Genbank数据库获得基因号为JN182923。该序列671 bp,其中18S rDNA部分序列14 bp，ІTS1 rDNA序列267 bp，5.8S rDNA序列143 bp，ІTS2 rDNA序列221 bp，28S rDNA部分序列27 bp。供比较的ІTS rDNA序列长度不一致，最长为Podoscypha multizonata(EU118663) 986 bp，最短为Hypochnicium lundellii(AY781277)菌株557 bp。

利用DANMAN软件分析25个菌株的ІTS rDNA序列，得到系统进化树（图3）。与Ab.1（JN182923）亲缘关系较近近的菌株是A.biennis（FJ608589）、A. biennis（EU232187）和Podoscypha multizonata（EU118663）， 与Genbank中FJ608589和EU232187序列相似度达到100%，确定Ab.1菌株是残孔菌属的二年残孔菌（A. biennis），由系统发育树推断二年残孔菌（A.biennis）是多元进化的。

3 讨 论

图3 基于ІTS rDNA序列的Abortiporus系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of Abortiporus based on ITS rDNA sequences

二年残孔菌Abortiporus biennis(Bull.)Singer属于菌物界Fungi，担子菌门Basidiomycota，伞菌亚门Agaricomycotina，伞菌纲Agaricomycetes，多孔菌目Polyporales，干朽菌科Meruliaceae，残孔菌属Abortiporus（Murrillet al.1904）。二年残孔菌Abortiporus biennis的同物异名有：Abortiporus distortus(Schwein.) Murrillet al.、Daedalea albidaPurton.、Grifola biennis(Bull.) Zmitr. &Malysheva.、PolyporussericellusSacc.、Polystictus rufescens(Pers.) P. Karst.、Trametesrufescens(Pers.)G.H. Otth.。主要分布在中国、日本以及西欧等国家，稀生于针叶树上，寄生于许多种类的阔叶树上或地下埋有腐木的地上，导致木材白色腐朽。生长在抗真菌能力很强的香樟树上还是首次发现，造成树叶提前发黄、落叶，生长缓慢，逐渐枯萎、死亡。世界分布广泛：中国、日本、挪威、丹麦、瑞典、英国、澳大利亚、美国；在中国，江苏、浙江、福建、山西、广西、海南等地均有该菌的报道[2-3]，该菌对园林植物造成的危害也越来越严重，逐渐受到关注。对该菌的研究大都是对其进行形态学描述和生态分布调查[2-5]；也有研究发现二年残孔菌A. biennis具有药用价值，能够抑制肿瘤[6]；二年残孔菌A. biennis通过分泌草酸而对有毒的金属氧化物有一定的耐受力[7-9]。

系统进化树中所选取的对比菌株属于不同的属，亲缘关系较近的聚类在一起，但ІTS rDNA序列都在80%的同源水平上与二年残孔菌A. biennis相似。本研究是首次将二年残孔菌A. biennis进行详细的形态描述、实验室培养及其ІTS区序列的PСR扩增测序，根据其ІTS序列构建系统进化树。对二年残孔菌A. biennis在国内的分布、子实体和菌落形态特征方面提供了重要的新信息，其分子结果有助于更大规模干朽菌科的系统发育研究，为该菌的鉴定提供可靠的依据，同时对该种病原菌的生物防治也有一定的意义。根据形态特征和分子系统分析相结合将Ab.1菌株鉴定为二年残孔菌A. biennis是比较科学的。

[1] 郑俊娟,林琦,刘 伟,等.瑞克纤孔菌在皂荚上的首次发现[J].菌物学报,2011,30(1): 128-132.

[2] 周文能,张东柱.野菇图鉴[M].台北:远流出版事业股份有限公司,2005:217.

[3] 戴玉成.中国储木及建筑木材腐朽菌图志[M].北京:科学出版社,2009:1-2.

[4] 戴玉成,崔宝凯.海南大型木生真菌的多样性[M].北京:科学出版社,2010:1.

[5] 赵继鼎.中国真菌志(第3卷)多孔菌科[M]. 北京:科学出版社,1998:62-63.

[6] 戴玉成,杨祝良.中国药用真菌名录及部分名称的修订[J].菌物学报, 2008,27(8):801-824.

[7] Graz M, Jarosz Wilkolazka A, Pawlikowska Pawlega B.Abortiporus biennis tolerance to insoluble metal oxides: oxalate secretion, oxalate oxidase activity, and mycelia morphology [J].BioMetals, 2009, 22(3):401-410.

[8] 周再知, 陈 羽,梁坤南,等.乡土用材树种与红菇菌高效共生体的筛选研究[J].中南林业科技大学学报 ,2011, 31(2):7-14.

[9] 王明生, 何 钢, 陈介男.双菌种同步糖化共发酵造纸污泥生产乙醇的研究[J].中南林业科技大学学报, 2011,31(7):151-155.

A new pathogenic fungi of Cinnamomum camphora: morphological identif i cation and ITS phylogenetic analysis of Abortiporus biennis

ZHENG Jun-juan, SHANG Yuan-yuan, HUO Сun-lu, FANG Ying-jie, HE Xin-sheng
(School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, Sichuan, Сhina)

A new pathogenic fungi of Cinnamomum camphora was reported. The morphological characteristics and microscopic observation of the pathogen were conducted. The specimen’s ІTS rDNA sequence was submitted to Genbank and acquired a gene number JN182923. Through blast comparison we got the relative sequences and made homology analysis by constructed the phylogenetic tree.Сombining traditional morphological identification and molecular identification,the ІTS rDNA sequence were determined, and ІTS rDNA system development was analyzed. The parasite was identif i ed as Abortiporus biennis and the phylogenetic tree indicates that Abortiporus biennis is probably polyphyletic．

Abortiporus biennis；morphological characteristics；ІTS rDNA；phylogeny

S718.81

A

1673-923X (2012)05-0073-03

2011-11-24

西南科技大学研究生创新基金项目（11ycjj41）

郑俊娟（1987-）,女,江苏丹阳人,硕士研究生,研究方向:野生蕈菌资源；E-mail:junjuan_zheng@126.com

贺新生（1965-）,男,四川金堂人,教授,主要从事食用药用蕈菌资源研究；E-mail:hexinsheng@swust.edu.cn

[本文编校：吴 毅]