白介素-23R基因多态性与肝癌易感性研究*

覃彦平，秦 雪

(1.广西壮族自治区柳州市红十字会医院检验科 545001;2.广西医科大学，南宁 530021;3.广西医科大学第一附属医院临床实验中心，南宁 530021)

肝癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一，全世界每年新发肝癌患者约60万人，位居恶性肿瘤的第5位。中国发病人数约占全球的50%以上，全球 55%肝癌病例发生在中国[1]。研究证实白介素-23R(IL-23R)基因的某些多态性位点与胃癌、卵巢癌、食管癌等有关[2-4]。但IL-23R基因多态性与肝癌的遗传易感性的关系尚不清楚。本研究对IL-23R基因rs10889677A/C、rs1884444G/T两个位点单核苷酸多态性(SNP)进行检测，以探讨这两个位点与肝癌的遗传易感相关性的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 实验分肝癌组和对照组2组，肝癌组84例，为2010年6～10月在广西医科大学第一附属医院因肝癌住院，未经化疗、放疗的患者，其中男73 例，女11 例，年龄21～69岁，中位年龄47.5 岁，HBsAg阳性84 例(100%)，AFP阳性55 例(65.5%)，肝功能ALT平均值为152.1 U/L，全部病例均经临床和病理检查确诊为肝癌。对照组94例，为同期健康体检者，其中男74 例，女21 例，年龄21～69岁，中位年龄44.5 岁，所有对照组体检结论为健康合格者。所有研究对象和实验标本的获得均符合伦理学原则。

1.2DNA标本 所有未经化疗、放疗的肝癌组患者和健康对照者均抽取外周静脉血5 mL,EDTA抗凝，采用苯酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，置于-20 ℃冰箱备测。

1.3引物设计 IL-23R基因的rs10889677、rs1884444两个基因序列PCR扩增引物参照文献设计[5-6]。引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4聚合酶链反应 采用DA-7300PCR反应仪，试剂购自Fermentas公司。PCR反应体系为25 μL，包括基因组DNA 2.0 μL，上下游引物(1 μmol/L)各1 μL，Dream TaqTM Green PCR Master Mix(2x)12.5 μL,不足体积用灭菌去离子水补充至25 μL。IL-23R基因rs10889677位点的PCR反应循环参数为：94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,62.8 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,36个循环；72 ℃延伸10 min。IL-23R基因rs1884444位点的PCR反应循环参数除退火温度为56 ℃外，其他反应条件同rs10889677。取产物5 μL经含有EB的2%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR扩增是否成功。

1.5扩增产物的限制性酶切 酶切反应体系均为20 μL，包括PCR产物10 μL，限制性内切酶(10 U/μL)1μL，反应缓冲液2 μL，灭菌去离子水补充至20 μL,37 ℃酶切过夜。其中rs10889677位点的限制性内切酶为Mnll,rs18844444位点则为HeaⅢ(限制性内切酶均购自Fermentas公司)。酶切产物与标准 DNA marker同步电泳(含EB的3%琼脂糖凝胶电泳)，观察基因型。

1.6基因型判断 (1) IL-23R基因rs10889677位点。CC基因型：完全切开，酶切产物有154 bp和62 bp两条带；CA基因型：未完全切开，酶切产物有216、154和62 bp 3条带；AA基因型：不能切开，酶切产物只有216 bp 1条带。(2) IL-23R基因rs18844444位点。GG基因型：完全切开，酶切产物有117 bp和19 bp两条带；GT基因型：未完全切开，酶切产物有136、117和 19 bp(片段太小，电泳不可见)3条带；TT基因型：不能切开，酶切产物只有136 bp 1条带。

M:对照组;9：CA基因型；5、6：CC基因型；1、2、4、7、8、10：AA基因型。

1.7测序鉴定 随机抽取10%的样本送至上海生工生物有限公司进行测序。测序仪器为ABI-PRISM3730。

1.8统计学处理 对照组和肝癌组经Hardy-Weinberg平衡检验分析后，采用直接计数计算基因型和等位基因频率；各组间等位基因频率和基因型分布频率差异采用χ2检验和危险性分析，计算比值比(OR)和95%可信区间(95%CI)。采用PLINK软件构建IL-23R基因rs1884444和rs10889677两个位点的单倍型并进行分析。

2 结 果

2.1IL-23R基因rs10889677、rs1884444位点酶切结果和测序结果 限制性内切酶产物经电泳分析后发现IL-23R基因rs10889677、rs1884444酶切后均可产生3种基因型，见图1、图2。测序结果和酶切结果均吻合。

2.2Hardy-Weinberg平衡检验 经Hardy-Weinberg平衡检验IL-23R基因rs10889677、rs1884444位点对照组和肝癌组基因型实际值与预测值比较结果P值分别为0.775、0.387，P>0.05，均符合Hardy-Weinberg平衡，显示本研究所检测样品具有代表性和可比性。

2.3IL-23R基因rs10889677、rs1884444位点肝癌组和对照组基因型及等位基因型分布比较 见表2。

表2 IL-23R基因rs10889677、rs1884444位点基因型、等位基因型在肝癌组和对照组中的分布[n(%)]

由表2可见肝癌组与对照组比较，IL-23R基因rs10889677位点AA、AC、CC基因型及A、C等位基因型分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。IL-23R基因rs1884444位点TT、TG、GG基因型及T、G等位基因型分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。显示IL-23R基因rs1884444基因多态性与肝癌的遗传易感性有关。危险分析显示T等位基因型与G等位基因型相比其OR值为1.636，95%CI为1.027～2.607，提示携带T等位基因型的个体较携带G等位基因型者发生肝癌的风险增加1.636倍。

2.4IL-23R基因rs10889677、rs1884444位点单倍型分析 采用PLINK软件对rs1884444和rs108896772两个位点进行单倍型构建，共构建出4种单倍型。由表4可见GA单倍型与肝癌的患病风险性有相关性(P=0.020 9),携带 GA单倍型的个体患肝癌的风险增加至1.72。其他单倍型与肝癌的患病风险性无相关性(P>0.05)。

表3 IL-23R基因rs10889677、rs1884444位点单倍型在肝癌组和对照组中的分布

3 讨 论

经研究发现已有多种炎性细胞因子介导的信号通路参与肝癌的发生、发展[5]。IL-23是一种与肿瘤有关的炎症性细胞因子[6]。IL-23R是IL-23受体复合物的2个亚基之一，主要的生物学作用是介导IL-23在细胞内的信号传导。IL-23需通过与其相应的IL-23受体复合物结合才能发挥其生物学功能。当IL-23与IL-23R结合后，可引发下游信号通路Jak2、Tyk2分子的激活，磷酸化受体胞内区的Stats结合位点，使Stats分子以二聚体方式聚集，磷酸化的Stats二聚体入核后，激活靶基因的转录。IL-23与IL-23R还能诱导记忆性CD4+T细胞向TH17细胞分化[7]。TH17细胞可高表达IL-17，并分泌大量促炎因子如：IL-6和TNF-α等[8]。TH17细胞可介导炎性反应、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生、发展[9]。而致炎细胞因子IL-17可以促进多种细胞亚群及巨噬细胞产生TNF、IL-8等促炎细胞因子，引起细胞浸润和组织破坏[10]。上述炎症因子构成了IL-23/IL-23R/TH17/IL-17通路，该通路是引起机体炎症及免疫紊乱的重要组成部分。由于肿瘤可源自慢性炎症[11]，Kuang等[12]揭示肿瘤可激活单核细胞分泌IL-23等细胞因子，触发TH17细胞分化和增殖；TH17细胞分泌的IL-17累积在肝癌中通过引起血管生成而促进疾病的进展。而作为IL-23/IL-23R/TH17/IL-17通路信号传递因子的IL-23R也极有可能与肝细胞癌变有关。本研究首次探讨了IL-23R rs10889677A/C及IL-23 R rs1884444G/T两个位点多态性与肝癌的关系。本研究结果显示IL-23R基因rs1884444位点基因型、等位基因型分布频率差异有统计学意义(P<0.05)。危险分析显示携带T等位基因型的个体较携带G等位基因型者发生肝癌的风险高。各单倍型中只有GA单倍型与肝癌的患病风险性有相关性(P=0.020 9)。说明了IL-23R基因rs1884444位点基因多态性可能与肝癌遗传易感性有关。而IL-23R基因rs10889677位点基因型、等位基因型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。该位点与肝癌的遗传易感性无明显相关性。

本研究的IL-23R rs10889677A/C及IL-23R rs1884444G/T两个位点均为Haploview上的标签SNP，分别位于外显子11和外显子2，二者都是由于碱基的取代而出现SNP(rs1884444是T→G，rs10889677是A→C)。基因序列中单个核苷酸的替代、插入或缺失，都会引起编码氨基酸的改变或导致转录的mRNA剪接的改变，影响基因表达与蛋白质的功能，从而导致疾病的发生。IL-23R基因多态性与食管癌、胃癌等的研究已证实IL-23R可能与某些炎症相关的肿瘤易感性有关。Zhang等[13]研究发现，IL-23R可通过交替剪接产生剪接异构体，并优先在肺癌中表达，进而推测该表达可能有助于细胞逃避机体的免疫监视或攻击，使IL-23R可能在某些癌症的发生、发展过程中发挥作用。Chen和Hsich[14]证实，IL-23R信号通路中的Stats3调控多种与细胞增殖及凋亡有关的功能蛋白的表达，Stats3的异常活化是引起子宫内膜癌的原因之一。本研究显示，与肝癌遗传易感性相关的IL-23R rs1884444基因位于外显子2，后者负责编码IL-23R的信号肽[15]，信号肽的功能是决定新生肽链在细胞中的定位或决定某些氨基酸残基修饰。虽然rs1884444已被报道与胃癌及食管癌等的遗传易感性相关，但rs1884444的功能目前还不明确，有待于进一步的功能学研究。

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