慢性鼻-鼻窦炎中金黄色葡萄球菌肠毒素基因研究

申 迹,项锦银△,寇 巍，洪苏玲

(1.重庆市长寿区人民医院眼耳鼻咽喉科 401220；2.重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科 400016)

慢性鼻-鼻窦炎的病理生理学机制到目前为止并未被充分认识，而且，被认为是多因素共同作用的结果。宿主的遗传背景、免疫功能的紊乱以及外界环境因素是慢性鼻-鼻窦炎发生、发展的重要诱因。最近研究显示细菌的定植，尤其是细菌产物，如金黄色葡萄球菌肠毒素可能参与了慢性鼻-鼻窦炎发病[1-2]。

金黄色葡萄球菌肠毒素可以引起多种人类的感染性疾病[3]，如食物中毒、新生儿坏死性皮炎、毒性休克综合征、坏死性出血性肺炎和皮肤、关节的感染等。金黄色葡萄球菌肠毒素在引起感染的同时可以作为超抗原与T淋巴细胞的MHC-Ⅱ分子Vβ受体区相结合引起T淋巴细胞的高效克隆，诱导免疫应答，而不需要特异性的抗原提呈、识别过程[4]。有研究结果发现金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D(sea,seb,sec,sed)与慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyposis,CRSsNP)和慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyposis,CRSwNP)的发病相关，提示金黄色葡萄球菌肠毒素参与了鼻-鼻窦黏膜的炎症反应[5-6]。本研究通过PCR技术首次检测国人慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉和慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻腔金黄色葡萄球菌肠毒素基因的携带情况，探讨与国人慢性鼻-鼻窦炎发病相关的金黄色葡萄球菌肠毒素基因类型。

1 资料与方法

1.1一般资料 2010年6月至2011年6月在重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉科及重庆市长寿区人民医院耳鼻咽喉科住院接受功能性鼻窦内窥镜手术治疗的慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉、慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉及鼻中隔偏曲患者，以中鼻道黏膜拭子金黄色葡萄球菌培养阳性的患者作为研究对象，共分为3组。慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉组(CRSwNP组)：110例，其中，男60例，女50例，平均年龄(38.54±11.36)岁，病程2～30年，平均病程(8.52±7.21)年。依照2007欧洲鼻-鼻窦炎鼻息肉诊疗意见书中的诊断标准[1]：(1)需要大于或等于2条下述症状：流涕[前鼻孔和(或)后鼻孔脓性分泌物]、鼻阻塞、嗅觉减退或丧失、面颊部疼痛/肿胀感，症状持续12周以上；(2)内窥镜检查证实单侧和(或)双侧中鼻道有息肉，源于中鼻道的脓性分泌物，源于中鼻道的黏膜水肿或阻塞；(3)CT鼻-鼻窦炎的影像学表现：窦口鼻道复合体和(或)鼻窦黏膜增厚，鼻中隔无偏曲。慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉组(CRSsNP组)：32例，其中，男18例，女14例，平均年龄(36.15±12.27)岁，病程1～30年，平均病程(8.43±6.56)年。依照2007欧洲鼻-鼻窦炎鼻息肉诊疗意见书中的诊断标准：(1)需要大于或等于2条下述症状，流涕[前鼻孔和(或)后鼻孔脓性分泌物]、鼻阻塞、嗅觉减退或丧失、面颊部疼痛/肿胀感，症状持续12周以上；(2)内窥镜检查排除单侧和(或)双侧中鼻道息肉，可以有源于中鼻道的脓性分泌物，源于中鼻道的黏膜水肿或阻塞；(3)CT鼻-鼻窦炎的影像学表现，窦口鼻道复合体和(或)鼻窦黏膜增厚，鼻中隔无偏曲。鼻中隔偏曲组(对照组)：44例，其中，男24例，女20例，平均年龄(30.54±10.36)岁，病程2～20年，平均病程(6.83±5.31)年。本实验结合鼻塞、头痛、鼻犁氏区出血等临床症状，变应原皮肤试验，鼻内窥镜和鼻窦CT检查进行诊断，排除慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉。为了使结果具有可比性，能够较真实反映慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉、慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉及鼻中隔偏曲患者金黄色葡萄球菌肠毒素基因的携带情况，所有患者过去均未曾接受抗菌药物、组胺拮抗剂、鼻腔冲洗和鼻腔糖皮质激素等保守治疗；无药物、食物过敏史，无哮喘史、真菌感染史；且均无鼻腔手术史，无高血压、糖尿病、高脂血等其他器官系统的疾病。

1.2研究方法 对3组患者的中鼻道黏膜拭子进行金黄色葡萄球菌分离培养，并根据美国临床实验室标准化协会的检验标准[7]，经法国Bio-Merieux公司的GPI系统鉴定为金黄色葡萄球菌，再应用PCR检测每例患者金黄色葡萄球菌样本18种肠毒素基因的携带情况，包括sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser。

1.2.1研究试剂及仪器设备 细菌鉴定仪：Vitek32全自动微生物分析仪(法国)；PCR扩增仪:T-gradient Biometra(德国)；凝胶电泳仪：DYY-10C(北京)；PCR试剂：购于TaKaRa公司。

1.2.2引物设计与合成 根据 Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的金黄色葡萄球菌18种肠毒素的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献[8],引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列见表1。

1.2.3DNA的提取 取每例患者中鼻道黏膜拭子分离培养出的金黄色葡萄球菌菌落放入400 μL双蒸水中混匀,100 ℃煮沸15～30 min后,10 000 r/min离心 5 min,吸取3 μL上清液作为PCR扩增模板。

1.2.4PCR扩增体系及反应条件 扩增反应体系：缓冲液5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTP 3 μL，引物1 μL，模板1 μL,再加灭菌去离子水至50 μL。扩增金黄色葡萄球菌肠毒素基因的热循环参数为：95 ℃预变性 4 min,95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,循环30次,72 ℃延伸 7 min。

1.2.5琼脂糖凝胶电泳 170 mg琼脂糖粉末与17 mLTBE缓冲液混合加热煮沸,冷却至60 ℃加入溴乙锭1.5 μL制备成1%的琼脂糖凝胶。1 μL上样缓冲液与6 μL PCR扩增产物混合后加入1%琼脂糖凝胶孔,水平式电泳槽电压100 V,电流80 mA,电泳时间为30 min。300 nm紫外灯观察结果,并用凝胶成像系统成像。

1.3统计学处理 应用费歇尔精确检验及χ2检验对实验数据进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

3个实验组患者金黄色葡萄球菌肠毒素基因的阳性检出率见图1。110例CRSwNP组患者中有92例患者至少检出1种肠毒素基因(92/110,84%),CRSsNP组为(30/32,92%)，对照组患者为(36/44，82%)，但3组阳性检出率的χ2检验差异均无统计学意义(CRSwNP组与对照组：P=0.25；CRSsNP组与CRSwNP组：P=0.22；CRSsNP组与对照组：P=0.23)。

表1 金黄色葡萄球菌肠毒素基因引物序列

表2统计了3组患者中每一种肠毒素基因的阳性检出例数：没有任何一种肠毒素基因在所有患者中均阳性检出；3组患者阳性检出例数均较高的几种肠毒素基因为：seg、sem、sen、sei、seo、seu,组间比较差异无统计学意义。通过费歇尔精确检验分析CRSwNP组与对照组每一种肠毒素基因阳性检出例数的差异，发现16例CRSwNP组患者表达肠毒素seq基因，而对照组无阳性检出，差异有统计学意义(P=0.03)；而CRSsNP组与CRSwNP组，CRSsNP组与对照组的每一种肠毒素基因阳性检出例数比较差异均无统计学意义(表2中未列出)。3组患者均未检测出肠毒素基因：sek(图2、3)。

表2 3组患者金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测结果

图1 3组患者金黄色葡萄球菌肠毒素基因的

图2 金黄色葡萄球菌肠毒素基因扩增产物

图3 金黄色葡萄球菌肠毒素基因扩增产物电泳图

3 讨 论

慢性鼻-鼻窦炎是上呼吸道黏膜的慢性炎症，其患病率占总人口的大约15%，对患者的生活质量产生一定程度的影响，并造成严重的社会经济负担。

欧洲鼻-鼻窦炎、鼻息肉诊疗指南对慢性鼻-鼻窦炎的定义做了一个比较全面的描述：慢性鼻-鼻窦炎是鼻腔和副鼻窦黏膜的慢性炎症反应，分为慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉和慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉2个亚型，患者的症状持续时间大于12周，而且鼻窦内窥镜检查及鼻窦CT检查结果均有特征性的表现。慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉通常占慢性鼻-鼻窦炎患者的20%。

目前，基因库(Genbank)已经证实的金黄色葡萄球菌肠毒素基因有18个：sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser。那么，除了肠毒素A、B、C、D，其他肠毒素是否亦与慢性鼻-鼻窦炎的发病相关。

本研究中慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉,慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉组及鼻中隔偏曲组金黄色葡萄球菌肠毒素基因的阳性检出率分别为84%、94%、82%。国内学者从医院呼吸内科患者的痰液中分离培养出的金黄色葡萄球菌，检测其肠毒素基因，阳性率为9.48%；赵建等[9]从医院食物中毒患者的呕吐物及相关食品标本中分离培养出金黄色葡萄球菌，肠毒素基因的阳性检出率为56.2%，均远低于本实验中各组患者金黄色葡萄球菌肠毒素基因的阳性检出率，提示金黄色葡萄球菌在宿主鼻腔的定植和克隆、肠毒素基因的翻译和表达及其与宿主免疫系统的相互作用是鼻腔、鼻窦黏膜慢性炎症过程的重要因素。

本研究首次发现金黄色葡萄球菌肠毒素基因seq在国人慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者中的阳性检出率与对照组比较差异具有统计学意义；金黄色葡萄球菌肠毒素基因seg、sem、sen、sei、seo、seu在3组中相对其他肠毒素基因有较高的阳性检出例数，但差异无统计学意义。以前实验研究较多的肠毒素sea、seb、sec、sed，其基因在3组中的阳性检出例数均较低，差异无统计学意义。最近研究发现金黄色葡萄球菌肠毒素seq在食物中毒的发病中有一定作用，但其与慢性鼻-鼻窦炎发病机制的关系还有待在本实验的基础上进一步深入探讨[10-11]。

近年，欧美及国内有学者提出“超抗原”假说[12]，认为金黄色葡萄球菌肠毒素作为细菌超抗原产物能够与宿主免疫系统相互作用，激活并增殖人体CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、抗原递呈细胞、嗜酸性粒细胞和上皮细胞产生相应的细胞因子、炎性介质，引发炎症级联反应，导致鼻腔外侧壁黏膜的炎性浸润、组织水肿及鼻黏膜假复层纤毛柱状上皮的毁损[13]。因此，金黄色葡萄球菌肠毒素超抗原可能是慢性鼻-鼻窦炎(伴和不伴鼻息肉)的始发因素，而且在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻黏膜中发现的金黄色葡萄球菌肠毒素特异性T淋巴细胞MHC-Ⅱ分子Vβ受体及IgE更支持了这一病理机制[14]。

本研究检测的是金黄色葡萄球菌肠毒素基因，而并非肠毒素蛋白本身。基因在翻译、表达为蛋白质的过程中会受到机体内环境及外界多种因素的影响，也就是说，虽然在本实验的菌株中检测到某种肠毒素基因的存在，但在复杂的鼻腔微环境中由于受到多种因素的调控，并不是金黄色葡萄球菌所携带的每个肠毒素基因都会表达为具有功能的毒素蛋白。最后这些基因是否会转录、翻译成肠毒素蛋白质，而且表达的量是多少，目前，蛋白质组学方法的灵敏度还不能够完整、准确地检测出。因此，对慢性鼻-鼻窦炎(伴和不伴鼻息肉)中实际表达存在的金黄色葡萄球菌肠毒素蛋白质谱的分析将更有意义，这也是作者今后的探索和挑战[15]，而且随着金黄色葡萄球菌在宿主免疫系统及局部微环境作用下产生的各种基因突变，更多新的肠毒素基因也有待去发现[16]。

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