神经肽P物质对高氧暴露下肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响及其对信号分子Gli1的调控*

杨 林，党红星，刘 聪，方 芳，许 峰

(儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆市“儿童发育重大疾病诊治与预防”国际科技合作基地，重庆医科大学附属儿童医院PICU，重庆 400014)

氧疗是临床上治疗呼吸系统疾病的常用方法，但长时间吸入高浓度氧，可产生大量的氧自由基，从而引起炎症、细胞损伤、坏死和凋亡，可导致各种急性或慢性肺损伤[1-2]。肺泡上皮细胞是高氧所致肺损伤的主要靶点，其损伤后的修复主要依赖于肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的增殖、分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞(AECⅠ)。AECⅡ细胞的功能状态是决定肺损伤病理转归的主要因素[3]。

神经肽P物质(SP)广泛分布于气道上皮细胞层内，可启动早期的神经源性炎症反应，参与对损伤细胞的修复、增殖、迁移、分化调控[4-5]。本课题组前期研究发现SP能够降低高氧诱导的氧化损伤，但调节的分子机制尚不完全清楚[6]。SHH信号通路是一种重要的信号转导通路，在细胞损伤修复中有着重要的作用，其成员包括SHH、Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)以及Gli，而Gli1是SHH信号通路最主要的效应分子[7-8]。研究发现SHH信号通路在肺的形态发生和器官形成中起着至关重要的作用[9-10]，并参与了胚胎形成、组织修复、创伤愈合[11-13]。

SP能否降低高氧暴露对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤，促进损伤后的修复，且是否与调控SHH信号通路有关，目前，相关研究甚少。本文探讨了高氧暴露及SP干预对AECⅡ细胞存活、凋亡及对SHH信号通路分子Gli1的影响，为高氧肺损伤预防和治疗提供理论指导和实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雌、雄性SD大鼠，体质量180～200 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，所有实验遵守国家关怀和使用实验动物的指导方针，本实验通过了重庆市伦理委员会审查。

1.2材料 SP(Abcam公司)，DMEM/F12培养基、胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(BBI公司)，AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物)，流式细胞仪(美国BD公司)，Gli1多克隆抗体(Abbiotec公司)，BCA蛋白定量检测试剂盒(北京百泰克公司)，荧光定量PCR仪FTC2000(加拿大)，RT试剂、荧光定量PCR试剂、sybr green Ⅰ(Shine Gene公司)。

1.3早产鼠AECⅡ的分离及培养 健康成年SD大鼠，雌雄按1∶1合笼交配，次日晨查见阴栓记为妊娠第1天，将孕鼠于孕第19天(足月为22 d)时行剖宫产取出早产鼠，分别用0.25%胰酶、0.3%胶原酶消化，采用差速离心和差速贴壁方法分离AECⅡ。AECⅡ纯化后24 h接近增殖状态，活性良好，用于实验。每天更换培养液并在相差显微镜下观察其形态和基本生长情况，巴氏染色法、透射电镜下观察培养细胞中是否存在板层小体，巴氏染色法检测细胞纯度，台盼蓝染色检测细胞存活率，细胞纯度达95%，存活率达90%。

1.4氧化损伤性细胞模型制备及实验分组 原代培养早产鼠AECⅡ，AECⅡ贴壁纯化后随机分组的办法将细胞分为空气组、高氧组、高氧+SP组。空气组和高氧组分别将AECⅡ置于氧体积分数为0.21(21%)和0.95(95%)的密闭氧仓中，高氧SP组于暴露前加入SP 1×10-8mol/L，再置于氧体积分数为0.95(95%)密闭氧仓暴露，各组细胞密闭氧仓均置于5% CO2培养箱，培养24 h后收集细胞检测。

1.5光镜和电镜下观察细胞形态 原代培养的AECⅡ细胞，分组培养24 h后收集细胞，通过透射电镜观察细胞形态。

1.6MTT细胞存活检测 AECⅡ细胞存活率通过3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)试剂盒检测，按说明书进行。

1.7AnnexinV/PI 双标记法检测 AECⅡ凋亡 原代培养的AECⅡ细胞，以1×106个/mL浓度接种于6孔板中，按上述分组处理24 h，胰酶消化贴壁细胞，PBS重悬3次，调整细胞浓度约1×106个/mL，加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，20～25 ℃避光孵育15 min，上流式细胞仪，计算出右下象限的早期凋亡细胞所占比率。

1.8荧光定量PCR检测Gli1的mRNA的含量 采用TRizol一步法提取AECⅡ的总RNA，测吸光度A260/A280值，计算提取的RNA浓度。逆转录合成cDNA，PCR引物由Primer premier 5.0自行设计。扩增Gli1基因正义链的引物序列：5′-TGT GGC AAC AGG ACG GAA C-3′，反义链序列为：5′-CCA GAG TGT CAG CAG AAG AAA AG-3′；GAPDH正义链的引物序列：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，反义链序列为：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。荧光定量PCR扩增条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃检测信号。记录deta Ct值，通过2-△△CT计算荧光值，并以GAPDH为标准计算相对比值。

1.9Western blot检测Gli1的蛋白含量 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白。取30 μg蛋白质上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜，经5%脱脂奶粉封闭后，与Gli1多克隆抗体适度稀释，4 ℃振摇孵育过夜，再加入稀释后辣根过氧化物酶标记的二抗，用ECL法检测，蛋白条带用Quantity One 4.5.0软件进行处理分析，蛋白含量用目的条带校正容积(Adj volume)/GAPDH校正容积(Adj volume)表示。

2 结 果

2.1高氧暴露及SP干预后AECⅡ形态学的变化 空气组：AECⅡ细胞胞浆丰富，含有大小不一的板层小体，胞膜上有微绒毛结构(封3图1A)。与空气组比较，高氧暴露24 h，AECⅡ细胞核较空气组伸展，细胞器减少，线粒体肿胀，板层小体结构变化甚至消失，胞质边缘有较多吞饮小泡，可见较多早期凋亡的改变(封3图1B)。SP干预后，与高氧组比较，细胞器变化减轻，细胞形态基本正常(封3图1C)。

2.2高氧暴露及SP干预对AECⅡ存活率和凋亡率的影响 与空气组比较，高氧组AECⅡ在高氧暴露24 h后细胞存活率明显降低，凋亡率明显升高(P<0.05)。而在高氧+SP组，SP干预后与单纯高氧组比较，AECⅡ存活率明显增加，凋亡率降低(P<0.05)，见图2、3。

*：P<0.05，与空气组比较；#：P<0.05，与高氧组比较。

*：P<0.05，与空气组比较；#：P<0.05，与高氧组比较。

2.3高氧及SP干预后Gli1 mRNA表达的影响 空气组AECⅡ，通过荧光定量PCR法可检测到Gli1 mRNA表达。与空气组比较，高氧暴露24 h后，AECⅡ内Gli1 mRNA表达升高(P<0.05)。SP干预后，进一步促进高氧组AECⅡ内Gli1 mRNA表达，高氧+SP组Gli1 mRNA水平较单纯高氧组升高(P<0.05)，见图4。

2.4高氧及SP干预对Gli1蛋白表达的影响 空气组AECⅡ，通过Western blot可检测到Gli1蛋白表达。与空气组比较，高氧暴露后，Gli1蛋白表达升高(P<0.05)。SP干预后，进一步促进高氧组AECⅡ内Gli1蛋白表达，高氧+SP组Gli1蛋白表达水平较单纯高氧组明显升高(P<0.05)，见图5。

*：P<0.05，与空气组比较；#：P<0.05，与高氧组比较。

*：P<0.05，与空气组比较；#：P<0.05，与高氧组比较。

3 讨 论

慢性肺疾病(CLD)或支气管肺发育不良(BPD)是新生儿持续用氧治疗后的一种肺氧化性损伤疾病，在存活的早产儿中可达60%以上，发生CLD或BPD的早产儿均伴有肺发育障碍和呼吸功能低下。目前，国际上尚无确定有效的防治方法，但大量临床资料显示其病因与肺的发育成熟及肺损伤修复密切相关[14]。

AECⅡ是肺泡表面一类重要的细胞群体，在肺泡上皮损伤时可不断增殖，补充和分化为AECⅠ，被称为肺泡上皮“干细胞”[15]。由于肺损伤的修复完全依赖AECⅡ的增殖和分化，因此寻找保护AECⅡ氧化损伤的因素，可为高氧肺损伤的防治提供理论基础。

SP是一种重要的感觉神经肽，SP释放后可以特异性地与神经激肽1受体(NK1R)结合，具有多种生物学效应，可调节气道血流，气道平滑肌收舒反应，气道炎症和上皮细胞损伤后的迁移和增殖[16-17]。急性烧伤患者，SP在增生的疤痕组织中的浓度明显高于烧伤皮肤，其可能启动愈合早期的神经源性炎症反应，与细胞增殖、再生和瘢痕形成等密切相关[4]。Oslund等[18]报道通过活化NK1R有助于肺损伤后上皮细胞增殖，是参与损伤修复的重要组件。Yaraee等[19]发现SP能够直接调节人支气管上皮细胞释放TGF-β，参与调节肺损伤修复以及肺纤维化过程。Marwan等[20-21]发现感觉神经递质通过激活NK1R能够保护急性高氧肺损伤。Huang等[6]发现SP对高氧肺损伤有明显的保护作用，可降低细胞凋亡，促进细胞存活。

本研究发现早产鼠AECⅡ高氧暴露24 h，电镜下可见明显的细胞损伤和凋亡，流式细胞仪检测细胞的凋亡率明显升高，细胞存活明显降低。SP干预后从细胞的超微结构可见损伤明显减轻，细胞凋亡率明显降低，细胞存活率升高。提示SP可以减轻AECⅡ的氧化损伤，维持细胞的正常生理功能，对氧化应激状态下的AECⅡ细胞可能起到保护作用。

在大量发育和肿瘤形成的研究成果中发现，SHH信号通路对细胞增生起调节作用，提示该信号途径也可能参与组织损伤修复和再生过程。Kusano等[11]报道体外心肌细胞给予SHH蛋白能够保护过氧化氢诱导的细胞凋亡。Lavine报道阻断正常成年小鼠在体心肌细胞中的SHH信号传导通路可以导致室腔增大，心肌纤维化，心功能降低甚至死亡。此外，文献报道SHH信号在骨折、胆道、肝脏损伤的修复中发挥作用[22-24]。然而，这一信号途径在呼吸系统，特别是对肺修复再生及AECⅡ细胞损伤修复中的作用还不十分明确。Bellusci等[25]报道SHH信号通路在肺的支气管形态发育中具有重要作用，转基因老鼠过表达SHH可促进间叶细胞和上皮细胞的增殖。SHH信号通路中的核转录因子Gli1有3种，即Gli1、Gli2、Gli3，Gli1是SHH信号途径最重要的下游转录因子之一，也是SHH信号最终的响应者和功能的执行者[26]。Grindley等[27]发现在肺组织SHH基因过表达时，Gli1 mRNA明显上调，参与肺发育的调控。因而，Gli1的表达反映了SHH信号通路的功能状态。

本研究显示，SHH信号通路参与了高氧诱导细胞凋亡的信号转导系统，高氧暴露后Gli1信号分子表达明显增加，可能参与高氧损伤后早期的防御作用。SP干预后，进一步激活高氧组AECⅡ内Gli1信号分子基因和蛋白表达，同时，AECⅡ凋亡率降低，存活率增加，显示对高氧暴露下AECⅡ起到一定的保护作用。提示SP可抑制细胞的凋亡，促进细胞存活，其可能通过对SHH信号途径激活而对氧化应激状态下的AECⅡ起到保护作用。

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