彭云玲,李伟丽,王坤泽,王汉宁
(甘肃省干旱生境作物学重点实验室 甘肃农业大学农学院,甘肃 兰州730070)
随着人口剧增和耕地减少的双重影响,人类始终面临着粮食问题。世界上盐渍土壤的面积很大,严重地影响全球农业的发展。利用盐渍土壤有多种途径,其中以培育和种植耐盐作物品种最为经济有效。作物耐盐品种筛选可以通过引种、杂交育种、细胞工程育种和基因工程育种进行;通过筛选作物耐盐种质并探讨其耐盐机理,可以为耐盐分子育种提供材料。玉米(Zeamays)作为主要的粮饲兼用作物,对盐分中度敏感,培育耐盐品种对农业生产具有重大的意义。目前国内外由于耐盐种质资源的匮乏,遗传基础狭窄,严重束缚了玉米耐盐性的研究和利用。因此,筛选玉米耐盐种质并对其研究,对玉米耐盐种质改良和耐盐品种选育具有一定的指导作用,并对玉米耐盐性遗传机理具有一定的理论意义。
目前在玉米耐盐性方面已有大量的研究,多集中在生理生化机理方面。王丽燕和赵可夫[1]、刘志伟和黄冠华[2]报道,玉米在盐胁迫下,生长受到明显抑制,整株鲜重和整株干重都明显下降;净光合速率降低,气孔导度下降,细胞间隙CO2浓度升高。商学芳[3]的研究结果表明,盐胁迫下,玉米杂交种净光合速率、叶绿素含量和根系活力明显降低,由此造成生长量减少,株高、叶面积、单株鲜重和单株干重都减少,且对地上部的影响大于对地下部的影响;并且盐胁迫下,SOD(超氧化物歧化酶,superoxide dismutase)、POD(过氧化物酶,peroxidase dismutase)和CAT(过氧化氢酶,catalase dismutase)活性与耐盐性呈正相关。马纯艳和李玥莹[4]发现玉米杂交种在低盐胁迫下SOD活性、POD活性升高,高盐胁迫下SOD活性、POD活性降低。汤华和柳晓磊[5]的研究表明出苗时间、苗高、地上部鲜重、根系鲜重、脯氨酸含量等指标与盐浓度的相关性很高,都可作为玉米的耐盐性鉴定的依据,并且认为200~220mmol/L是玉米耐盐性筛选的临界上限浓度。郑世英等[6]报道盐胁迫条件下,玉米的叶绿素含量、净光合速率、根系活力及生长量均随着盐胁迫浓度的提高而逐渐降低。盐胁迫下不同耐盐玉米品种之间的差别以及耐盐自交系和盐敏感自交系的研究报导较少。仅见付艳等[7]报道,玉米高度耐盐自交系黑玉米与盐敏感系黄早四相比,叶绿素含量高,脯氨酸、MDA(丙二醛,malondialdehyde)含量及组织外渗液的相对电导率低,且变化幅度小。本研究借鉴王宁[8]、付艳等[9]玉米种质耐盐性鉴定方法,对13份玉米自交系的耐盐性初步分析,筛选出了2份玉米耐盐自交系和1份盐敏感自交系。对筛选出的3份自交系材料在盐胁迫条件下萌发期和苗期的耐盐性变化进行全面的比较研究,旨在探讨玉米的耐盐机理,为玉米耐盐品种选育和耐盐基因挖掘提供材料,为玉米耐盐遗传机理研究奠定基础。
13份玉米自交系 A413、65232、TS141、8723、P138、81162、昌7-2、廊黄、87-1、117、136、137、9046由甘肃省农科院与甘肃农业大学提供。2010年在生长室对13份玉米自交系品种进行初步耐盐性分析。在盐溶液浓度为220mmol/L的蛭石中生长10d后,幼苗变黄干枯等危害程度按以下规则分级,0级:叶片正常未受盐害;1级:仅有少数叶片边缘有轻度的变黄干枯;2级:半数以上的叶片变黄干枯死亡,但主茎未死;3级:半数以上叶片变黄干枯死亡,主茎死亡;4级:植株完全死亡。最后计算各品种玉米幼苗受害率,再具体分级:耐盐品种、较强耐旱品种、较弱耐旱品种、旱敏感品种。按耐盐级别筛选出的品种:8723和81162(耐盐自交系)、P138(盐敏感自交系)作为实验材料。其中8723来源于引进玉米自交系8723,81162来源于525×掖107后代材料,P138来源于美国杂交种P78599的后代材料。
2011年5月对耐盐自交系8723和81162、盐敏感自交系P138进行萌发期和幼苗生长期的耐盐性比较研究。
种子萌发试验:精选无破损、大小一致的种子,用0.5%的次氯酸钠消毒10min,蒸馏水冲洗3~5次,用滤纸吸干附着水,置于直径为12cm的培养皿中,双层滤纸作发芽床,每皿30粒。分别加入浓度为0,100,140,180,220mmol/L的NaCl溶液,3次重复。置于培养箱中25℃暗中萌发。
幼苗培养试验:用15cm×13cm的营养钵进行培养,并设置0,100,140,180,220mmol/L五个不同浓度的NaCl溶液的胁迫处理,每种处理设3次重复。营养钵中加入100mL各对应浓度的NaCl溶液与500g已灭菌的蛭石搅拌均匀。播种前种子用0.5%的次氯酸钠消毒10min,蒸馏水冲洗3~5次,然后将种子分别浸泡在0,100,140,180,220mmol/L五个不同浓度的NaCl溶液中,浸泡12h后,直接播在含有相同盐浓度的消毒蛭石中,每钵10粒。播种后于植物生长室中培养,生长室的昼夜温度为(25±2)/(20±2)℃,每天光照12h,光照强度为600μmol/(s·m2),相对湿度60%~80%,定时定量浇水。
1.3.1 发芽指标的测定 培养第4天后,每24h记录发芽种子数直至发芽试验结束,统计种子的发芽率、发芽势、胚芽长度、发芽指数、活力指数、盐害指数。种子发芽率(%)=发芽的种子粒数/供试种子粒数×100;种子发芽势(%)=规定时间内发芽的种子粒数/供试种子粒数×100;胚芽长度直接用尺子测量胚芽基部到胚芽顶部的距离;发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt);活力指数(VI)=∑(Gt/Dt)×S=GI×S。式中,Gt为t日的发芽数,Dt为相应的发芽日数,S为平均胚芽重量;盐害指数(%)=(对照发芽率-盐处理发芽率)/对照发芽率×100。实验设3次重复,取其平均值。
1.3.2 生长指标测定 幼苗在加有不同浓度盐溶液的蛭石中生长10d,对照叶片生长到三叶一心时,进行生长各项指标的测定。
株高和根长的测定:盐处理后直接用尺子测量玉米幼苗的株高和主根长。每品种每处理取样5株,取其平均值,实验做3次重复。
鲜重的测定:将各处理玉米幼苗从营养钵中小心取出,用水冲洗掉其根部附着的蛭石,并用吸水纸吸干其表面水珠,剪开苗的根系和地上部分,分别于天平上称重。每处理取样5株,取其平均值,实验做3次重复。
1.3.3 生理指标测定 相对含水量测定:小心的剪下3个自交系各处理玉米幼苗的倒数第2片叶,立刻称其鲜重;然后把这些叶片充分浸泡在去离子水中2h后,用纸巾吸去叶子表面的水分后称重;最后,这些叶片在80℃烘过夜然后称干重。各个盐浓度下每个自交系3次重复。RWC(相对含水量,relative water content)用下面的公式计算:
相对电导率测定:称取3个自交系各处理玉米幼苗的倒数第2片叶0.5g左右,先用自来水冲洗去除表面的污物,再用无离子水冲洗2次,用吸水纸吸去多余的水分。将材料切成1cm长度的小段,放进加了20mL的去离子水的50mL离心管内,真空抽气30min去除叶片表面的气泡,叶片沉入管底后,轻摇装有样品的试管3h,用电导仪测定初始电导率R1;而后样品在沸水中煮20min后,冷却至室温,测定总的电导率R2。相对电导率用如下公式表示:
实验数据采用Microsoft Office Excel软件进行统计分析。
2.1.1 盐胁迫下耐盐系与盐敏感系玉米萌发的形态特征 盐胁迫条件下3个自交系种子的萌发受到抑制,并且随着盐浓度的增加抑制程度加剧,这种抑制作用主要表现在胚芽和胚根生长受到影响。由于不同玉米自交系的基因型不同,盐胁迫条件下的表现不同。在对照条件下,盐浓度为0mmol/L,3个材料种子的萌发都很好,胚芽和胚根生长趋于相同的趋势(图1);随着盐浓度的增加,3个自交系胚芽和胚根的生长受到的抑制都逐渐增加,但不同自交系受到的抑制程度不同。如盐浓度为180mmol/L条件下,8723的胚根仍有生长,但是很短,胚芽的生长较胚根长,但是明显细弱;81162受到的抑制与8723类似,只是其胚根的生长已经完全被抑制,胚芽更加细弱;P138受到的抑制作用最为明显,在这个盐浓度下没有胚芽和胚根长出。盐浓度为220mmol/L时,盐胁迫对不同自交系胚芽胚根的抑制作用更加明显,耐盐系8723没有胚根伸出,胚芽很短,很细弱;81162比8723更严重,没有胚根,也没有胚芽;P138仍然没有胚芽和胚根长出。
图1 不同浓度NaCl胁迫下不同自交系玉米的萌发状况Fig.1 Germination of seed in different inbred lines of maize under different concentrations of NaCl stress
2.1.2 NaCl胁迫对玉米种子发芽率和发芽势的影响 随着NaCl浓度的增大,3份材料的发芽率和发芽势均有下降趋势,但因材料不同,变化的程度也不同。0mmol/L NaCl浓度下,3个品种的发芽率差别较小,都在89%左右(图2A),当NaCl浓度由0增至100mmol/L NaCl时,盐胁迫对种子萌发的影响已经逐渐显现出来,表现为发芽率下降,但是3个品种差别不大。当盐浓度升到140mmol/L时,耐盐系8723和81162的发芽率还保持在80%以上,而P138发芽率迅速下降。NaCl浓度为180和220mmol/L时,8723和81162的发芽率仍有下降,但是下降较缓慢,而P138的发芽率迅速下降。同时,3个玉米品种的发芽势均随NaCl浓度的增加而降低(图2B),其中P138随着NaCl浓度的增加,发芽势急速降低,由0mmol/L NaCl时的56.3%降至220mmol/L NaCl时的0。8723和81162随着NaCl浓度的增加发芽势逐渐降低,由0mmol/L NaCl时的66.7%降至220mmol/L NaCl时的26.7%,且发芽整齐度较高,说明8723和81162耐盐胁迫能力强。
综上所述,随着NaCl浓度的增加,3个自交系的发芽率和发芽势都呈下降趋势;只是在各个盐浓度下,耐盐自交系8723和81162的发芽率和发芽势高于盐敏感系P138,表现出极强的种子活力,说明这2个自交系受NaCl影响较小。在不同盐浓度的处理结果中也可以看出,耐盐系8723和81162相比有较强的耐盐性。
图2 不同浓度NaCl胁迫下不同自交系玉米种子发芽率和发芽势的比较Fig.2 Comparison of germination rate and germination potential in three inbred lines of maize under different concentrations of NaCl stress
2.1.3 NaCl胁迫对玉米种子发芽指数和活力指数的影响 随着NaCl浓度的增加,不同玉米自交系的发芽指数均呈下降趋势 (图3A);但是在不同NaCl浓度处理下,玉米耐盐自交系8723和81162的发芽指数均高于盐敏感系P138,这说明盐浓度的增加对耐盐系8723和81162的影响相对较小,而对盐敏感系P138的影响较大。在各个盐浓度下,8723和81162之间发芽指数也存在显著差异,8723的发芽指数高于81162。与此同时,不同材料间的活力指数在不同盐浓度下的表现与发芽指数一致(图3B)。随着NaCl浓度的增加各自交系种子的活力指数逐渐降低。P138随着NaCl浓度逐渐增加,活力指数由对照的10降至NaCl为200mmol/L时的0,说明该自交系在各浓度NaCl溶液的处理下,发芽较差,生长活力低下,NaCl对其的影响较大。在各浓度的NaCl溶液处理下,耐盐系8723和81162活力指数较高,且均高于盐敏感系P138,并且耐盐系8723的活力指数高于81162。
图3 不同浓度NaCl胁迫下不同自交系玉米种子发芽指数和活力指数的比较Fig.3 Comparison of germination index and activity index in three inbred lines of maize under different concentrations of NaCl stress
2.1.4 NaCl胁迫对玉米种子盐害指数和胚芽生长的影响 3个自交系的盐害指数随着盐浓度的增加而升高(图4A),0mmol/L NaCl浓度下,3个材料的盐害指数都为0,说明在这个条件下3个材料的种子没有受到盐胁迫,而后随着盐浓度的增加,盐害指数逐渐增加,但是不同自交系增加的程度不同;各个盐浓度下,耐盐系的盐害指数低于盐敏感系。如100mmol/L NaCl浓度下,8723、81162和P138的盐害指数分别是6.7%,10.7%,14.3%;当 NaCl浓度升高至220mmol/L时,8723、81162和P138的盐害指数随之增加,分别是25.0%,32.3%,57.7%。
随着盐浓度的增加胚芽长度呈逐渐下降的趋势(图4B),各材料间胚芽长度降低的程度随盐浓度的增加而不同。耐盐系8723和81162胚芽长度随盐浓度的增加下降幅度较盐敏感系P138缓慢,其耐盐性显著高于P138。另外,在实验中同时也对3个自交系在不同盐浓度下的胚根长度进行了测量,其变化趋势和胚芽一致,只是P138的胚根对盐浓度的变化更为敏感,100mmol/L NaCl浓度下,P138的胚根生长已经受到严重抑制,基本没有胚根长出,无法统计。180mmol/L NaCl时,81162的胚根生长受到抑制,无法统计。
图4 不同浓度NaCl胁迫下不同自交系玉米种子盐害指数和胚芽长度的比较Fig.4 Comparison of salt injury index and plumule length in three inbred lines of maize under different concentrations of NaCl stress
2.2.1 NaCl胁迫对玉米耐盐系与盐敏感系幼苗形态的影响 植株受到盐害后在形态上表现为植株矮小瘦弱、叶片狭窄、基部黄叶多,随着时间的延长叶片失水萎蔫进而卷曲枯萎,严重时植株全部死亡。本研究采用盆栽实验探索了盐胁迫对玉米幼苗生长的影响。NaCl胁迫对玉米幼苗生长具有显著抑制作用,作用强度随NaCl浓度增加和胁迫时间延长而加剧。受害程度的轻重与玉米的基因型有关,耐盐系8723和81162幼苗随着盐浓度的增加其生长基本不受影响,而P138随着盐浓度的增加和处理时间延长其受害逐渐加重;幼苗新叶抽生速度和面积扩展受到明显抑制,玉米幼苗叶片黄化枯死现象加剧(图5)。如在盐浓度为100mmol/L处理下3个自交系玉米幼苗受盐害都较轻,随着盐浓度的增加差异逐渐表现出来,在220mmol/L NaCl浓度下处理10d后,耐盐系8723和81162的幼苗叶片基本上没有枯死的情况发生,生长没有受到影响,而P138叶面积均因幼苗基部叶片枯死而减小,生长受到严重影响。
2.2.2 NaCl胁迫对玉米耐盐系与盐敏感系株高和根长的影响 玉米在NaCl溶液胁迫下,生长受到抑制,不同NaCl浓度处理对不同玉米自交系幼苗的株高和根长的影响不同。从地上部长势来看,首先表现为株高变矮,3个自交系的株高具有较一致的变化规律(图6A),即均随NaCl溶液浓度的增加呈逐渐下降的趋势,但各浓度NaCl溶液处理下耐盐系8723和81162的株高明显高于盐敏感系P138,并且8723和81162的株高下降幅度小于盐敏感系P138,这说明在株高方面,NaCl对耐盐系的影响较小。与株高的变化趋势一致,在根长方面,3个自交系的变化趋势都随着盐浓度的增加而呈下降的趋势(图6B),在0mmol/L NaCl条件下,8723和81162的根长分别是30.0和36.5cm,P138的根长是44.0cm,3个自交系的根长有差异,这可能与不同的玉米材料有关。之后随着NaCl浓度的增加3个自交系的根长逐渐下降,到NaCl浓度为220mmol/L时,8723、81162和P138的根长分别是16.0,22.0和15.8cm。盐胁迫下8723和81162根长的下降趋势较P138缓慢,这说明NaCl溶液对8723和81162根的生长影响较小;P138在0mmol/L NaCl条件下时的根长最长,而随着盐浓度的增加根长急速下降,到220mmol/L时,下降至15.8cm,说明NaCl溶液处理对P138幼苗根长的影响较大。
图5 NaCl胁迫下不同自交系玉米幼苗的生长状况Fig.5 Growth of seedlings in different inbred lines of maize under 220mmol/L concentration of NaCl stress
图6 不同浓度NaCl胁迫下不同自交系玉米株高和根长的比较Fig.6 Comparison of height and root length of seedlings in different inbred lines of maize under different concentrations of NaCl stress
2.2.3 NaCl胁迫对玉米耐盐系与盐敏感系苗期地上部和根系鲜重的影响 在盐浓度为0mmol/L时,也即对照条件下,3个自交系的地上部鲜重基本没有差异,都在9g左右(图7A),之后随着盐浓度的增加,3个自交系地上部鲜重均呈下降趋势,但8723和81162下降的速度较P138缓慢。盐浓度增加为220mmol/L时,8723、81162、P138地上部分重量分别为6.01,5.87,3.55g,耐盐系与盐敏感系的差异非常明显,P138的生物量极低,此时幼苗茎叶枯萎,接近死亡。说明盐浓度达220mmol/L时,P138已经不能正常完成生长发育过程,对P138的伤害接近盐胁迫的上限,但是对8723和81162的伤害明显低于P138。根系鲜重的比较结果表明(图7B),随着盐浓度的升高,玉米的根系鲜重也呈明显下降趋势,这与地上部鲜重的变化趋势相似。
图7 不同浓度NaCl胁迫下不同自交系玉米地上部和根系鲜重的比较Fig.7 Comparison of fresh shoot and root weight in different inbred lines of maize under different concentrations of NaCl stress
相对电导率是衡量细胞膜透性的一个标准,相对电导率高,破坏程度大,反之亦然。0mmol/L NaCl条件下,3个自交系的电解质渗出率都很低,随着盐浓度的增加相对电导率都逐渐增加(图8A),但变化的程度不同,8723和81162相对电导率的变化趋势是随着盐浓度的增加上升较为缓慢,而P138的相对电导率随着盐浓度的增加上升较为迅速,说明8723和81162两个材料在盐胁迫下的细胞膜通透性比P138低,几乎不受盐胁迫的影响。这也反映出8723和81162的耐盐性明显好于P138。
图8 NaCl胁迫下不同自交系玉米相对含水量和相对电导率的比较Fig.8 Comparison of relative water content and relative conductivity in different inbred lines of maize under NaCl stress
盐胁迫下,由于植物细胞大量失水造成植物的生理干旱,从而对植物体造成伤害。因此,盐胁迫下玉米幼苗的相对含水量是衡量其耐盐性的一项重要指标。3个玉米自交系的相对含水量在不同浓度NaCl溶液胁迫下的变化趋势较为一致,均表现为随NaCl溶液浓度的增加呈下降的态势(图8B),但随NaCl浓度的增加耐盐系8723和81162相对含水量的下降幅度很小,没有明显变化,而盐敏感系P138的相对含水量下降幅度较大,且在各浓度NaCl处理下,耐盐系8723和81162的含水量均高于盐敏感系P138。
在不同盐浓度胁迫下,发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数都可以作为判断作物耐盐性的指标。李孔晨和卢欣石[10]、张培培等[11]都通过种子萌发时的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数筛选出了耐盐品种和盐敏感品种;张国伟等[12]报道可将发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和鲜质量的盐害系数作为棉花(Gossypiumhirsutum)萌发期耐盐鉴定的指标。本实验结果表明,随着盐浓度的增加,玉米种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和胚芽长度一直呈下降趋势,盐害指数呈上升趋势。其中,随着盐浓度的增加耐盐系8723和81162变化幅度小;盐敏感系P138变化幅度大,这与高英等[13]的结果低盐条件能满足玉米种子幼芽生长所需的水分,促进种子生根、发芽,玉米种子的芽长、根长、形态反应明显地优于对照不太一致,这可能与所用的最低浓度不同有关,在本实验中所用的最低盐浓度为100mmol/L。综合发芽实验各项指标的结果,8723有较81162更强的耐盐性。
植株鲜重和根鲜重是反映作物苗期生理状态的重要指标,能直接反映作物受盐害的程度。王丽燕和赵可夫[1]、孙巧玲[14]发现,在NaCl胁迫下,地上部分鲜重和干重明显减少,随盐处理浓度的升高,玉米的整株鲜重与干重都呈明显下降趋势。张海艳和赵延明[15]的研究结果表明,幼苗高度、幼苗鲜重和根长、根鲜重在不同NaCl溶液浓度处理下表现极显著变化,玉米生长受到抑制,随着NaCl浓度的升高,生长抑制更加显著。国外学者Asif等[16]、Sairam等[17]在研究中也有同样结论。本实验有同样的研究结果,随着盐浓度的增加,玉米地上部鲜重、根鲜重、苗高、根长等指标呈下降趋势,但因材料不同下降的幅度不同,8723和81162下降较P138缓慢,盐敏感系P138的新叶抽生和叶面积扩展也受到了明显抑制。但是该结果与刘爱荣等[18]、景艳霞和袁庆华[19]报道的低浓度NaCl处理生长有一定促进作用,而高浓度NaCl抑制生长的结果不太一致,这可能与在幼苗生长时所用的最低浓度有关。这些结果表明,8723和81162较P138有较强的耐盐性,更加适合作为盐碱地或咸水灌溉条件下的作物。
植物细胞膜是控制小分子物质进出细胞的屏障,膜透性常用相对电导率来衡量。植株的相对电导率反映的是细胞膜在渗透胁迫下受到伤害的程度,植物在遭受到盐胁迫时,相对电导率越低,表明细胞质电解液外渗的越少,细胞膜受到破坏的程度越低,细胞受到的伤害也越小,该植物抗盐胁迫能力越强[20,21]。孟林等[22]的研究结果认为细胞膜透性随着盐胁迫浓度的加大而增加,盐浓度增加膜透性变化最小的材料耐盐性越强;赵宇玮等[23]对小麦(Triticumaestivum)盐胁迫下细胞膜透性的变化也是随着盐浓度的增加细胞膜透性增大;邹丽娜等[24]报道随着盐浓度的增加,紫穗槐幼苗细胞质膜的透性增加,本研究结果与其基本一致。本实验中,耐盐自交系和盐敏感自交系的相对电导率都随着盐浓度的增加而增加,耐盐品种8723和81162的变化幅度小于盐敏感品种P138。盐胁迫下玉米幼苗的相对含水量也是衡量其耐盐性的一项重要指标。本实验中,随着NaCl浓度的增加,3个自交系的相对含水量呈下降趋势,耐盐系8723和8723相对含水量的下降幅度很小,几乎没有明显变化,而盐敏感系P138的相对含水量下降幅度较大,且在各浓度NaCl处理下,耐盐系8723和81162的含水量均高于盐敏感系P138,这与孟林等[22]、许能祥等[25]的研究结果一致。
本实验结果对玉米育种材料选择具有一定的参考价值。就外部形态的观察来说,盐胁迫下,耐盐品种8723和81162植株健壮,叶色浓,盐敏感品种P138植株瘦弱,叶色淡。说明都与玉米不同基因型之间的耐盐能力大小有关,亦即品种的耐盐性是受基因控制的、可遗传的。在受盐碱危害的玉米产区选择耐盐性较好的高产品种,增强玉米对盐碱胁迫的自我调节能力,是农业获得丰收的重要保证。由于本实验探讨了在实验室条件下盐胁迫对不同玉米材料萌发和幼苗生长的影响,但实际上盐土常含多种盐分,不同无机离子之间存在着相互作用,同时幼苗的耐盐性与成熟植株的耐盐性是否一致还有待研究。因此,关于玉米在实际盐碱土壤条件下的耐盐性状况尚需进一步探讨研究。
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