动态高压微射流对猪胰脂肪酶的影响

尹 曼刘 伟钟业俊刘成梅黄 波

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047）

动态高压微射流对猪胰脂肪酶的影响

尹 曼1，2刘 伟1，2钟业俊1，2刘成梅1，2黄 波1，2

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047）

以猪胰脂肪酶（PPL）为原料，研究动态高压微射流（DHPM）对酶活性和构象的影响。结果显示：DHPM处理对PPL具有钝化作用，处理压力越大，钝化作用越小；4℃下贮存24 h，相对酶活有所回升。通过紫外光谱和圆二色谱分析DHPM对PPL构象的影响，发现经100 MPa DHPM处理后，PPL的紫外吸收强度降低，β－折叠含量减少，但随着处理压力增大，紫外吸收强度和β－折叠含量逐渐增大；4℃放置24 h后，紫外吸收强度和β－折叠含量进一步上升。PPL的相对酶活与紫外吸收强度、β－折叠含量呈一定的正相关。

动态高压微射流技术；猪胰脂肪酶；酶活；构象

脂肪酶（lipase，E.C.3.1.1.3）即甘油酯水解酶，可催化甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸，在食品、化妆品、洗涤剂、造纸、制药等领域应用广泛［1］。脂肪酶只能在异相系统即油水的界面上作用［2］。尽管不同来源脂肪酶的氨基酸组成不同，但分子量都在20 000～60 000，且活性中心具有相同或相似的结构，一般由丝氨酸、天冬氨酸／谷氨酸、组氨酸组成三联体［3］，酶分子空间结构的中央是1个疏水的β－折叠，其周围包绕着两亲的α－螺旋，3个氨基酸以高度保守的几何取向位于中央β－折叠一侧的“环”中［4］。

酶的催化活性和构象变化之间的关系一直是研究热点。R W McCabe等［5］研究发现在极端酸和碱性条件下，南极假丝酵母脂肪酶酶活发生钝化，二级结构发生相应变化。Francesco Secundo等［6］研究了洋葱假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶在纯有机溶剂中活性和构象的变化。

动态高 压微射流（dynamic high－pressure microfluidization，DHPM）是一种新兴高压技术，该技术建立在高压微射流均质机基础上，集输送、混合、超微粉碎、加压、膨化等多种单元操作于一体，液体物料在振荡中，被分成两股或更多股细流，然后在极小空间进行强烈的垂直撞击或Y型撞击，在撞击的过程中瞬间释放出大部分能量，产生巨大的压力降，能对流体混合物料进行强烈剪切、高速撞击、压力瞬时释放、高频振荡、膨爆和气穴作用等一系列的综合作用［7］。

本课题组前期研究［7－9］发现，DHPM处理对梨汁多酚氧化酶和蘑菇多酚氧化酶有激活作用，对胰蛋白酶的热稳定性有提升作用。本试验以猪胰脂肪酶为原料，研究DHPM处理压力对其活性的影响及低温放置24 h后活性的变化；采用紫外光谱、圆二色谱研究DHPM对酶构象的影响，分析酶活性与构象变化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，简称 PPL，E.C.3.1.1.3）：Sigma公司；

橄榄油：国药集团化学试剂有限公司；

聚乙烯醇、氢氧化钠等：均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

动态高压微射流均质机（最高处理压力为200 MPa）：M－110E，美国 Microfluidic公司；

圆二色光谱仪：MOS－450，法国Bio－Logic公司；

数显恒温水浴锅：HH－4，上海贺德实验设备有限公司；

离心机：Anke LXJ－ⅡB，上海安亭科学仪器厂；

高速分散机：T25，德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 PPL酶液的配制 将0.1 g猪胰脂肪酶溶于100 m L的磷酸钠缓冲液（p H 7.7，10 m M）中，5 000 r／min离心15 min，取上清液，考马斯亮蓝染色法测定酶溶液浓度［10］。

1.3.2 处理压力及贮存时间对脂肪酶活力的影响 酶溶液采用微射流均质机，（20±3）℃下进料，分别在100，150，200 MPa下各处理1次，处理过程中用冷凝水迅速冷却至室温。收集样品后迅速进行测定，或转移至4℃冰箱中贮存24 h后测定。未经动态高压微射流处理的PPL酶液设为对照组。

1.3.3 脂肪酶活性的测定 采用橄榄油乳化法［11］。

橄榄油乳化液的配制：2%的聚乙烯醇和橄榄油体积比3∶1，混合后用高速分散机随机搅动6 min，制成橄榄油乳化液，现用现配。

取4 m L橄榄油乳化液底物和5 m L磷酸钠缓冲液（100 m M，p H 7.7）于锥形瓶中，37℃水浴保温，加入1 m L酶液，振荡，保温15 min后加入15 m L乙醇溶液（95%）终止反应。向锥形瓶中滴加3～5滴酚酞作为指示剂，摇匀，用0.05 mol／L氢氧化钠标准溶液滴定。空白试验为先加入15 m L乙醇溶液（95%），再加入1 m L酶液。在一定条件下，每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量定义为1个脂肪酶活力单位（U）。相对活性为经DHPM处理后PPL酶的酶活与对照组酶活之比：

1.3.4 紫外光谱分析 采用法国 Bio－Logic MOS－450仪器进行紫外扫描，在200～360 nm范围内扫描得到吸收光谱。

1.3.5 圆二色谱（CD谱）分析 试验所用圆二色谱为Bio－Logic MOS－450型多功能圆二色光谱仪，0.1 cm的石英样品池。扫描波长范围为250～190 nm，重复4次。扫描速度为0.1 s／nm，带宽1.0 nm，测定温度为（25±1）℃。圆二色性用平均残基椭圆值［θ］表示，单位为（mdeg·cm2）／dmol或mdeg。利用DichroWeb在线软件SELCON3计算酶的二级结构构象单元的百分含量［12］。

2 结果与分析

2.1 DHPM不同压力处理对PPL活力的影响

PPL经100，150，200 MPa的DHPM处理后0 h和4℃贮藏24 h后的相对酶活变化见图1。由图1可知，DHPM处理对PPL活力有不同程度的钝化作用，且处理压力越大，钝化作用越小；低温放置24 h，酶活力有一定回升。

图1 不同压力下PPL的相对酶活Figure 1 Relative residual activities of PPL treated under different pressure

PPL酶液经过微射流均质机的反应腔时，受到强烈剪切等一系列作用，分子构象发生变化，进而影响酶活性中心的结构。在不同压力处理下，酶的催化活性有不同程度的降低［13］，因为压力对酶空间构象的破坏程度是不同的。在本试验中，150 MPa和200 MPa下对酶的活性位点的破坏力可能比较小，因此酶活力降低程度较小，圆二色谱的结果也支持了这一结论。处理后随着保存时间的增加，酶的构象逐渐向低自由能的天然构象回复，不同压力下PPL酶活都有一定的回升。

2.2 DHPM对PPL紫外光谱的影响

蛋白质的发色基团存在于各种微环境中，微环境的性质决定于蛋白质分子结构，微环境随构象改变而改变，微环境改变发色基团的紫外可见吸收光谱也随之改变。因此由发色基团紫外吸收光谱的变化可以了解微环境的变化，从而推断DHPM作用引起的脂肪酶分子构象的变化。

图2、3表示DHPM处理对PPL紫外吸收光谱的影响。由于50 MPa下酶的紫外吸收强度与未经处理的酶相比较而言，没有显著性差异，因此本试验未将结果列出。

图2 DHPM对PPL紫外吸收光谱的影响（0 h）Figure 2 UV absorption spectra of PPL treated under various pressures

对照组PPL的紫外吸收强度和最大吸收峰位置为0.389 88和266 nm；经100，150，200 MPa的 DHPM 处理后，PPL的最大吸收峰位置基本保持不变。经100 MPa和150 MPa DHPM处理，PPL的紫外吸收强度降低，这可能因为PPL酶经100 MPa处理后，PPL分子的内部Trp和Tyr残基被包埋的更为“紧密”，但随着处理压力增大，脂肪酶的紫外吸收强度增大，这可能是因为随着处理压力增大，Trp和Tyr残基逐渐暴露出来。经不同压力处理后，PPL酶分子由折叠态向去折叠态转变，酶分子的内部残基逐渐暴露，其结果与刘伟等之前研究胰蛋白酶的结论相似［9］。低温放置24 h后，PPL的紫外吸收强度进一步上升，分子内部残基进一步暴露。

图3 DHPM处理后4℃贮藏24 h的PPL紫外吸收光谱Figure 3 UV absorption spectra of PPL treated under various pressures after 24 h storage at 4℃

2.3 DHPM对PPL二级结构的影响

蛋白质中α－螺旋构象的CD谱在222 nm处和208 nm处呈负峰，在190 nm附近有一正峰；无规卷曲构象的CD谱在198 nm附近有个负峰，在220 nm附近有一个小而宽的正峰；β－折叠的椭圆值不像α－螺旋那样恒定，负峰移到220，195 nm的正峰与α－螺旋相似［14］。本试验得到的CD谱线符合构象出峰特征，且β－折叠的特征峰比较明显（如图4和图5），这与Yao等［15］报道的“脂肪酶是一种以折叠构象为主的蛋白酶”相一致。

图4 DHPM处理压力对PPL CD谱的影响（0 h）Figure 4 Effect of DHPM pressure on the CD spectra of PPL

图5 DHPM处理后4℃贮藏24 h的PPL CD谱Figure 5 Effect of DHPM pressure on the CD spectra of PPL after 24 h storage at 4℃

利用SELCON3软件计算脂肪酶的二级结构含量，对照组PPL的β－折叠含量为48.9%，经100，150，200 MPa的DHPM 处 理 后，PPL 酶 的 β－折 叠 含 量 分 别 为42.6%，49.2%，50%；4℃贮藏24 h后，PPL酶的β－折叠含量分别为44.2%，51.6%，53.8%，而100 MPa和200 MPa下，DHPM处理后24 h，α－螺旋含量有所增加（见表1）。可见，经100 MPa DHPM处理后，β－折叠含量减少，随着处理压力的增加，β－折叠含量增大；4℃贮藏24 h后，各组PPL的β－折叠含量均有一定的升高。

表1 DHPM处理压力对PPL二级结构百分含量的影响Table 1 Effect of DHPM on the percentage content of lipase secondary structures ／%

这些变化趋势与PPL的相对酶活的变化趋势一致（见图6），表明PPL相对活性和β－折叠的含量呈一定的正相关性。该结果与Fu Dayan和杨瑞金等的研究较为一致。Fu Dayan等［11］研究了解脂耶氏酵母脂肪酶热钝化和构象变化之间的关系，结果显示酶钝化伴随着分子二级和三级结构的变化和聚合。杨瑞金等［16］研究发现高压脉冲电场处理导致胃蛋白酶钝化，而钝化和酶的β－折叠结构含量的降低密切相关。

图6 PPLβ－折叠与相对活性随DHPM处理压力的变化Figure 6 Changes ofβ－sheet and relative activity of PPL with DHPM pressure

3 结论

（1）100，150，200 MPa的DHPM 处理对PPL活力有不同程度的钝化作用，且处理压力越大，钝化作用越小；低温放置24 h，酶活力有一定回升。

（2）紫外光谱的变化表明：经100 MPa DHPM处理，PPL的紫外吸收强度降低，PPL分子内部的赖氨酸和色氨酸残基被包埋的更为“紧密”，但随着处理压力增大，脂肪酶的紫外吸收强度逐渐增大，低温放置24 h后，PPL的紫外吸收强度进一步上升，分子内部的残基进一步暴露。

（3）CD谱的变化表明：经100 MPa DHPM处理后，β－折叠含量减少，随着处理压力的增加，β－折叠含量增大；4℃贮藏24 h后，各组PPL的β－折叠含量均有一定的升高。这些变化趋势与PPL的相对酶活的变化趋势一致，两者变化呈一定的正相关。

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Effect of dynamic high－pressure microfluidization on porcine pancreatic lipase

YIN Man1，2LIU Wei1，2ZHONG Ye－jun1，2LIU Cheng－mei1，2HUANG Bo1，2

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China；2.Engineering Research Center of Biomass Conversion，Ministry of Education，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China）

The effect was studied of dynamic high－pressure microfluidization（DHPM）treatment on porcine pancreas lipase（PPL）enzyme activity and conformation.PPL was inactivated after DHPM treatment and the higher pressure，the less inactivationis.The relative activity increased during 24 h storage at 4℃.UV and CD spectra analysis showed，after DHPM treatment in 100 MPa，the UV absorption andβ－sheet content reduced.Yet the UV absorption andβ－sheet content increased with the increase of treat pressure.After 24 h storage at 4 ℃，the UV absorption andβ－sheet content was further increased.The results showed that the relative activity was correlated with UV absorption andβ－sheet content positively.

dynamic high－pressure microfluidization；porcine pancreatic lipase；activity；conformation

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.002

国家自然科学基金资助项目（编号：31000209）；食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目（编号：SKLF－MB－201004）

尹曼（1985－），女，南昌大学在读硕士研究生。E－mail：yindaxianer＠163.com

通迅作者：刘伟

2011－03－09