李晨,陈宏文
(华侨大学 工业生物技术福建省高校重点实验室,福建 泉州 362021)
米曲霉木聚糖酶高产菌株选育
李晨,陈宏文
(华侨大学 工业生物技术福建省高校重点实验室,福建 泉州 362021)
以米曲霉C-2为出发菌株,紫外诱变后,利用透明圈初筛,再分别以农业废弃物1%蔗渣-1%麸皮复合物、2%蔗渣、2%碱提蔗渣半纤维素和2%纤维素溶剂分馏法(CSLF)提取的蔗渣半纤维素为碳源摇瓶复筛,得到一株高产木聚糖酶的米曲霉菌株A73.结果表明:米曲霉A73在上述碳源培养基中,产木聚糖酶酶活力比出发菌株分别提高了281.15%,82.81%,56.09%和33.11%;CSLF蔗渣半纤维素诱导米曲霉C-2及其诱变菌株产酶能力较弱,明显低于其他3种诱导物.
木聚糖酶;米曲霉;紫外诱变;纤维素溶剂木质纤维素分馏法;半纤维素
半纤维素是以木聚糖为主要成分的杂多糖,在自然界碳水化合物中含量仅次于纤维素.木聚糖酶是将木聚糖(半纤维素)降解成低聚木糖或木糖的木糖苷键水解酶酶系[1].目前的工业生产中,木聚糖酶生产菌主要涉及杆菌、放线菌及真菌中的酵母和霉菌,其中丝状真菌如曲霉类黑曲霉、瑞氏木霉等因产酶水平高于酵母菌和细菌而引起关注[2].米曲霉(Aspergillus oryzae)具有许多独特的生物特征,能胞外分泌大量的木聚糖降解酶,如β-1,4-D-内切木聚糖酶、β-1,4-D-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等[3-5].人们期望能利用其木聚糖酶的水解物木糖生产燃料乙醇、食品和医药保健品低聚木糖、多元糖醇等,或者直接生产食品级酶制剂.因此,提高木聚糖酶酶活力是米曲霉有效利用半纤维素(木聚糖)用于自身生长和发酵的关键,但关于米曲霉木聚糖酶的相关报道较少.纤维素溶剂木质纤维素分馏法(cellulose solvent-based lignocellulose fractionation,简称CSLF)[6]是近几年来提出的,利用纤维素溶胀试剂浓磷酸、有机溶剂丙酮和水来分离纤维素、半纤维素和木质素的新方法.该方法处理条件温和(常压,50℃)、时间短(2~4h)、试剂易回收,所得到的纤维素去结晶明显,酶触及性高;而且,糠醛、羟甲基糠醛、酚类衍生物和乙酸等抑制副产物少,通过高效液相色谱检测的木聚糖(半纤维素)提取率可达45%~65%[7-9].但是,目前还没有关于CSLF半纤维素成品利用的报道.本文以米曲霉C-2为出发菌株,通过紫外线诱变,分别利用农业废弃物蔗渣-麸皮复合物、蔗渣、碱提蔗渣半纤维素和CSLF半纤维素筛选木聚糖酶高产菌株,并考查了CSLF半纤维素诱导米曲霉C-2及其诱变菌株产木聚糖酶的效果.
(1)材料 .米曲霉菌株C-2,实验室保存菌种.蔗渣榨汁后用水清洗,尽量去除蔗渣中残留的蔗糖,置于60℃烘箱4d烘干.将干燥的蔗渣用中药粉碎机粉碎,筛取40~60目蔗渣粉备用(保存于燥剂器中).丙酮(AR级,国药集团化学试剂有限公司);磷酸(AR级,广东汕头西陇化工厂);无水乙醇(AR级,福建厦门德邦化工有限公司).
(2)仪器.4K15型大容量高速冷冻离心机(德国Sigma公司);D2F-6020型真空干燥箱(上海博源实业有限公司);DKZ-2型电热恒温震荡水槽(上海精密实验设备有限公司);UV-2800AH型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司).
(1)基础培养基(质量分数):2%葡萄糖,1%蛋白胨,0.5%KH2PO4,0.1%NaNO3,0.007%Uracil,0.015%Uridine,0.1%MgSO4·7H2O,1.5%琼脂,pH=6.0.
(2)初筛双层培养基:下层为1.5%水琼脂层,上层为碱提半纤维素培养基,即将基础培养基的葡萄糖用碱提半纤维素替代.
(3)种子培养基(液体基础培养基):复筛培养基碳源分别为1%蔗渣粉-1%麸皮,2%蔗渣粉,2%碱提蔗渣半纤维素,2%CSLF蔗渣半纤维素,其他与基础培养基相同.
1.3.1 蔗渣半纤维素的提取 蔗渣半纤维素提取采用如下两种方法:(1)碱提法 .详见参考文献[10];(2)CSLF法 .称取1g的蔗渣粉,加入8mL质量分数为85%的浓磷酸,搅匀,于50℃,150r·min-1下水浴振荡40min;加入冰冷的丙酮充分搅拌停止反应,使溶于磷酸的纤维素和半纤维素析出,以及不溶于磷酸的木质素溶于40mL的预冷丙酮中 .在7 000r·min-1下离心10min,弃去含有木质素的上清丙酮溶液,再用40mL丙酮洗涤沉淀3次,以去除残余木质素和磷酸,得到总纤维素(纤维素和半纤维素)沉淀;同上述方法再用40mL蒸馏水洗涤总纤维素沉淀3次,以分离溶于水的半纤维素和不溶于水的纤维素.最后,通过调节pH值抽滤、减压蒸馏,以及利用半纤维素不溶于乙醇的特点,在7 000r·min-1下离心10min,用3~4倍体积的无水乙醇将水提液中的半纤维素醇沉分离出来.
1.3.2 菌种诱变 斜面接种,于30℃静置培养3d,加入10mL无菌水,用接种环将所有孢子刮下,经4层擦镜纸过滤得孢子悬液.将孢子悬液镜检并适当稀释到103~104个·L-1备用.
紫外线灯(30W)预热20min,取2mL上述孢子悬液于直径为90mm的培养皿(用黑色胶带全部粘住以避光)中,放置在紫外灯30cm(垂直距离)处照射 .照射时匀速晃动平板使得照射均匀.将照射过的菌液于暗室放置2h后,稀释103倍和104倍,分别涂布到基础培养基平板,涂布量为每个器皿0.2 mL,于30℃避光静置培养2d,然后,计数菌落,计算致死率(η)并绘制致死率曲线.
1.3.3 菌株的筛选 (1)初筛.挑取诱变平板上所有的菌落到半纤维素双层培养基平板上,于30℃培养3d,然后挑选平板上生长快且HC值(HC=透明圈直径D透明圈/菌落直径D菌落)大的菌落,传2代后点接到初筛培养基上进一步筛选,筛取HC值大的菌落,缩小复筛量.(2)复筛.将初筛选出的菌株转接到基础斜面培养基继续传种3代.在45mL种子培养基中接种2环菌体,于30℃,200r·min-1下培养24h后,抽滤培养基得到菌球并接种到250mL摇瓶发酵,发酵培养基装液量50mL.接种后用8层纱布扎口,置于30℃,200r·min-1培养箱培养96h,测木聚糖酶酶活力.
1.3.4 木聚糖酶酶活的测定 取摇瓶培养液于4℃,12 000r·min-1离心10min,得上清粗酶液.用桦木木聚糖(birch wood xylan)做为底物.称取1.0g桦木木聚糖,尽可能溶解于80mL 0.05mol·L-1的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH=6.8)中,121℃灭菌15min,取出后摇匀木聚糖溶液使其充分溶解;冷却至室温后,再用上述缓冲液定容至100mL,配制成质量分数为1%的木聚糖溶液,置于-20℃保存备用.取0.9mL上述木聚糖溶液到试管中,于50℃预热1min,加入适当稀释的粗酶液0.1mL,50℃反应3min,利用DNS法[11]测定产生的还原糖.木聚糖酶酶活力(z)的计算式为
其中:M为酶液稀释倍数;A为酶解溶液中木糖的含量;V为酶液量;t为酶解时间.酶活单位的定义:在50℃,pH=6.8的最适合条件下,每秒钟使得每摩尔底物桦木木聚糖转化所需的酶量.
利用CSLF法提取得到的半纤维素水提液用CaCO3调节pH值,一边加入CaCO3一边不停搅拌,当pH值达到4~5时停止加入;静置10min后抽滤得到清液,再利用旋转蒸发仪减压蒸馏得到浓缩液,用3~4倍无水乙醇进行醇沉,静置得到白色半纤维素沉淀;然后,于7 000r·min-1离心10min得到半纤维素,用95%乙醇离心洗涤2次,再真空干燥至恒重.
醇沉前,溶液pH值对半纤维素醇沉形态和得率有重要影响.随着pH值的升高,半纤维素得率先升后降,但在pH值为4~5之间得率最高且变化不大.醇沉前溶液的pH值小于3或大于7时,半纤维素为颗粒状,形成沉淀难,醇沉速度慢;而pH值在3~5时,醇沉的半纤维素为絮状,醇沉速度快.干燥之后得到的半纤维素为白色或浅棕色粉末状,难溶于pH值大于4的水溶液,降低pH值可以使其慢慢溶解为棕色溶液,再提高pH值又可使其再沉析出来 .因此,CSLF半纤维素为酸溶性物质.
紫外灯功率30W,照射距离30cm,分别照射0,45,90,135,180,225s后稀释涂布平板,30℃培养2d计数.结果表明,稀释104倍时菌落生长数目和分散度较适宜 .计算其致死率(η),绘制致死率曲线,如图1所示.实验选择致死率在75%的紫外线剂量[12],照射时间为173s.
采用紫外线照射剂量173s作为诱变剂量,稀释104倍后涂布于基础培养基.30℃培养2d后共挑取73株菌落点接到双层培养基上,培养3d出现明显透明圈.将培养皿置于冰箱中过夜,使得透明圈更清晰,测量透明圈和菌落直径,计算菌落HC值.挑选HC值较大的23株,传2代后点接到初筛双层培养基上进行第2次透明圈筛选 .根据HC值大小选取6株菌株进行复筛,分别编号为A26,A33,A48,A54,A69和A73,其HC值和透明圈分别如表1,图2所示.
图1 出发菌株C-2的致死曲线Fig.1 Lethal curve of initial strain C-2
表1 菌株的HC值Tab.1 HC values of strains
图2 透明圈法筛选木聚糖酶高产菌Fig.2 Transparent circle screening for high-yield xylanase strains
蔗渣-麸皮、蔗渣、碱提蔗渣半纤维素和CSLF蔗渣半纤维素碳源诱导各菌株的产酶情况,结果如表2所示.
表2 碳源对各菌株产酶的影响Tab.2 Effect of carbon sources on xylanase production by strains
2.4.1 蔗渣-麸皮复合碳源 从表2可知:以蔗渣-麸皮为碳源,菌株A69产酶能力较出发菌株C-2提高42.94%,低于其他菌株,菌株A26和A33产酶能力相近,菌株A73的木聚糖酶酶活力最高,较出发菌株C-2提高2.81倍.
2.4.2 蔗渣碳源 从表2可知:以2%蔗渣为碳源,菌株A48的产酶能力较弱,比出发菌株C-2仅提高4.50%;菌株A73产酶能力最强,是出发菌株C-2的1.83倍.与麸皮-蔗渣复合碳源相比,包括出发菌株C-2在内的7个菌株生产的木聚糖酶酶活力都有所上升,但产酶能力提高幅度低于复合碳源培养基.
2.4.3 碱提蔗渣半纤维素碳源 从表2可知:菌株A73的木聚糖酶酶活力最高,在出发菌株C-2基础上提高了56.09%,而菌株A48却最低,仅仅提高了23.21%.
2.4.4 CSLF蔗渣半纤维素碳源 从表2可知:CSLF蔗渣半纤维素诱导各菌株产木聚糖酶的能力明显低于其他诱导底物.与出发菌株C-2相比,菌株A48在以蔗渣和碱提蔗渣半纤维素为碳源的培养基中产酶能力几乎没有提高,但是在CSLF蔗渣半纤维素诱导下比出发菌株C-2提高了51.97%.
虽然组成型生产木聚糖酶[13]亦有报道,但是木聚糖酶主要是诱导酶,受到培养基中木聚糖和富含木聚糖物质的诱导合成和分泌.农业废弃物小麦麸皮、玉米芯、甘蔗渣和水稻秸秆等都可以用于木聚糖酶的诱导生产.实验结果表明:在以蔗渣-麸皮、蔗渣和碱提蔗渣半纤维素为诱导物的培养基中,菌株A73产木聚糖酶酶活力在7种菌株中都是最高,相对出发菌株C-2都有大幅度的提高,蔗渣-麸皮诱导甚至高出2.81倍.7个菌株中,大多菌株在不同诱导物中的产酶能力都有较大变化,但菌株A73在几种诱导物间产酶能力最稳定.
对4种碳源的诱导能力(表2)进行比较可以发现:除菌株A73外,其他所有菌株在以蔗渣为诱导物时产木聚糖酶酶活力几乎是蔗渣-麸皮的两倍,略低于碱提半纤维素;而以CSLF半纤维素为碳源时,酶活力显著降低.总体来说,碱提半纤维素诱导该7株米曲霉产木聚糖酶能力最强,蔗渣其次,CSLF半纤维素最弱.
CSLF蔗渣半纤维素诱导各菌株产木聚糖酶酶活力非常低.一般来说,半纤维素抽提过程中常有乙酸、糠醛,羟甲基糠醛和酚类衍生物等抑制性副产物生成,对菌株代谢具有抑制作用.但是,CSLF法提取条件温和,较少产生抑制性副产物糠醛等[6],并且半纤维素水提液经减压蒸馏后,抑制副产物基本去除.因此,CSLF蔗渣半纤维素诱导米曲霉C-2及其诱变菌株生产的木聚糖酶酶活力较低与抑制性副产物无关.
米曲霉代谢木聚糖过程中,木聚糖大分子无法进入细胞中,而诱导木聚糖酶的物质主要是由少量组成型木聚糖酶水解木聚糖形成的低分子量的木聚糖片段 .因此,木聚糖酶的表达水平受到酶作用底物木聚糖的性质(如易感性)、浓度、释放低聚木糖的速率和释放量影响.另外,CSLF法得到的半纤维素为乳白色,与天然木质素颜色相近[14].该方法得到的半纤维素中可能含有木质素成分.因为在木质纤维素中,纤维素与半纤维素和木质素通过氢键相连,而半纤维素和木质素之间除了氢键,还通过化学键连接紧密形成稳定的木质素-碳水化合物结构(LCC)[15].
CSLF法处理木质纤维素过程中,木质素和半纤维素之间的化学键可能没有全部断裂,而是形成大量水溶性片段LCC.由于LCC片段为两亲性[16],不能溶解在弱极性的有机溶剂中[17].因此,在对提取浓缩液进行醇沉时,LCC片段随分离出的半纤维素一起沉淀下来.CSLF法提取的蔗渣半纤维素为乳白色粉末状,酸溶性,其成分、含量和结构性质,以及其对产木聚糖酶的影响都有待进一步研究.
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Breed of Aspergillus oryzae Producing High-Yield Xylanase
LI Chen,CHEN Hong-wen
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Fujian Province University,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)
Aspergillus oryzae C-2was treated with ultraviolet irradiation.High-yield xylanase mutant A73was obtained after primary transparent circle screening and secondary screening in which 4different carbon sources-1%wheat bran-1%sugarcane bagasse,2%sugarcane bagasse,2%alkali pretreatment hemi-cellulose and 2%CSLF(cellulose solvent-based lignocellulose fractionation)pretreatment hemi-cellulose were used as fermentation substrates.The xylanase activity of Aspergillus oryzae A73improved 281.15%,82.81%,56.09%and 33.11%compared with the original strain on respective carbon source,but the xylanase activity induced by CSLF pretreatment hemi-cellulose was apparently lower than that of other substrates.
xylanase;Aspergillus oryzae;ultraviolet irradiation;cellulose solvent-based lignocellulose fractionation;hemi-cellulose
钱筠 英文审校:刘源岗)
Q 933;TQ 914.3
A
1000-5013(2011)06-0663-05
2011-03-23
陈宏文(1969-),女,副教授,主要从事生物工程和基因工程的研究.E-mail:chenhw@hqu.edu.cn.
福建省自然科学基金资助项目(D0810015);教育部留学回国人员科研启动项目(2010);福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划项目(07FJRC03)