超临界CO2萃取－反相高效液相色谱测定海南对虾壳中虾青素的含量

周雪晴，冯玉红，谢艳丽，赵振东

(海南大学 分析测试中心，海南 海口 570228)

超临界CO2萃取－反相高效液相色谱测定海南对虾壳中虾青素的含量

周雪晴，冯玉红，谢艳丽，赵振东

(海南大学 分析测试中心，海南 海口 570228)

采用超临界CO2萃取技术，研究了从海南对虾壳中提取虾青素的工艺，同时采用正交实验方法研究了其最优化萃取条件，结果表明:萃取压力为35 MPa，萃取温度为60℃，夹带剂为100 g样品用15 mL二氯甲烷，萃取时间为2 h.最后用高效液相色谱法对萃取产物中的虾青素进行了测定，色谱柱:waters novapak C18 3.9 ×150 mm 不锈钢柱;流动相为V(甲醇)∶V(二氯甲烷)∶V(水)=50∶2∶3;流速:0.6 mL·min－1;波长:478 nm;线性范围10 ～100 mg·L－1，相关系数0.999 2;回收率为99.01%.

超临界CO2萃取;正交试验;虾青素;HPLC

虾青素(Astaxanthin)［1－2］是一种天然非维生素A源的类胡萝卜素，它广泛存在于虾、蟹、鱼中，具有抑制肿瘤、抗氧化、抗癌变、增强免疫功能等多方面的生理作用，可用作抗癌变的预防治疗剂、抗衰老剂、食品着色剂等等［3］，是一种具有很大发展前途的生物工程产品，因而它在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有着广阔的应用前景［4］.

虾青素的提取方法很多，如乙醇提取、丙酮提取、二氯甲烷提取等，但这些方法存在有机溶剂残留的现象，会对人体造成伤害.超临界CO2流体提取法操作简便，无环境污染，提取效果较好，无有机溶剂残留，因而在天然产物的提取方面倍受青睐［5－6］.因此，本研究以虾青素含量作为试验指标，采用正交实验设计方法，并利用超临界CO2流体萃取工艺对海南对虾壳中的虾青素进行了提取.

1 实验部分

1.1 仪器Spe-ed SFE型超临界流体萃取仪(美国Applied Separations公司);Waters2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器(美国waters公司);SB5200DT超声波振荡器(宁波新芝生物科技股份有限公司);AL204-IC电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司).

1.2 材料海南对虾壳(已脱钙，采自海南);液体CO2(海口曙光，纯度99.99%);虾青素标准品(Sigma公司);色谱纯甲醇(Fisher);二氯甲烷(为广州化学试剂厂分析纯试剂).

1.3 方法

1.3.1 超临界CO2萃取选取对超临界流体萃取效率有较大影响的4个因素:萃取温度、萃取压力、夹带剂用量、萃取时间，用正交实验进行优化考察，各因素各取3个水平，按表1进行试验.

表1 正交实验因素水平

称取粉碎后的海南对虾壳粉末200 g，装入萃取釜中，在一定温度和压力下进行超临界CO2提取，二氯甲烷为夹带剂，萃取完毕后，收集萃取物，备用.

1.3.2 虾青素测定方法

1.3.2.1 色谱条件 美国waters液相色谱仪;色谱柱:waters novapak C18 3.9×150 mm不锈钢柱;流动相为V(甲醇)∶V(二氯甲烷)∶V(水)=50∶2∶3;流速:0.6 mL·min－1;检测器:UV;波长:478 nm;进样量:20 μL;外标法定量.

1.3.2.2 样品分析方法 收集不同条件下所得萃取产物，减压回收夹带剂，得浸膏，称取萃取物10 mg于100 mL量瓶中，流动相溶解并定容至刻度，得样品溶液.微孔滤膜(0.45 μm)过滤后测定虾青素的含量.

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的制作精密称取虾青素对照品10 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇－二氯甲烷(体积比3∶1)稀释至刻度，摇匀，得虾青素标准储备液.

取标准储备液，依次稀释成质量浓度为10，20，40，80，100 mg·L－1的标准使用液，按上述色谱条件进行测试，虾青素标准品谱图见图1，以峰面积Y为纵坐标，虾青素质量浓度X(mg·L－1)为横坐标进行线性回归，得回归方程为:Y=27 461X－44 922(R2=0.999 2)，线性范围为10 ～100 mg·L－1.

图1 虾青素标准品图谱

2.2 精密度实验取质量浓度为20 mg·L－1的虾青素标准液，按1.3.2.1中的色谱条件重复进样6次，测出色谱峰的面积，通过计算求得虾青素色谱峰面积的相对标准偏差为1.18% ，结果列于表2.

表2 精密度实验结果

2.3 回收率试验称取样品3份，置于100 mL的量瓶中，分别精密加入虾青素对照品溶液，加入V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=3∶1的混合液，稀释至刻度，摇匀.按上述色谱条件测定，平均回收率为99.01%，RSD=1.51%.

2.4 正交实验结果分析根据选定的L9(34)正交表安排实验，并对结果进行极差分析，结果见表3.表3结果表明，各因素对海南对虾壳中虾青素萃取率的影响程度依次为A＞C＞B＞D，最优的萃取方案是A3＞C2＞B3＞D2，即:萃取压力为35 MPa，萃取温度为60℃，萃取时间为2 h，夹带剂为100 g样品用15 mL二氯甲烷.

表3 L9(34)正交实验结果

2.5 最佳工艺验证实验取200 g粉碎的虾壳粉末，按最佳工艺条件A3＞C2＞B3＞D2进行验证实验，测得虾青素的提取率为0.099 6%，大于正交实验的最大值，说明优化是成功的.

3 结论

超临界CO2从海南对虾壳中提取虾青素的过程中，夹带剂的加入可大大改善萃取效果.正交实验结果表明，超临界CO2萃取虾壳中虾青素的最佳工艺条件为:萃取压力为35 MPa，萃取温度为60℃，夹带剂为100 g样品用15 mL二氯甲烷，萃取时间为2 h.

以V(甲醇)∶V(二氯甲烷)∶V(水)=50∶2∶3为流动相，采用反相高效液相色谱方法测定海南对虾壳中虾青素的含量、灵敏度、精密度均较高，回收率好，可作为虾青素的检测方法.

［1］陈晋明，王世平，陈敏.反相高效液相色谱法测定虾青素［J］.化学分析计量，2006，15(2):27－29.

［2］NISHINO H.Cancer prevention by carotenoids［J］.Mutat Res，1998(402):159－163.

［3］张明祥，赵建国.国内外虾青素的研究进展［J］.粮食与饲料工业，2002，12(1):26－27.

［4］郑裕国，王远山，薛亚平.抗氧化剂的生产及应用［M］.北京:化学工业出版社，2004，45－49.

［5］MIKI W.Biological functions and activities of animal caroteniods［J］.Pure Appl Chem，1991，63(1):141 －142.

［6］应国庆，王晓艳，沈寅初.高效液相色谱法分析检测虾青素［J］.食品与发酵工业，2001，27(11):43－46.

Determination of Astaxanthin from Hainan Penacus Orientalis with Supercritical CO2-reversed phase HPLC

ZHOU Xue-qing，FENG Yu-hong，XIE Yan-li，ZHAO Zhen-dong

(Center of Analysis and Testing，Hainan University，Haikou 570228，China)

In the report，supercritical CO2fluid extraction(SFE)was used to extract Astaxanthin from Hainan Penacus orientalis and four factors and three level orthogonal experimental design was used to optimize the SFE conditions.The results indicated that the optimum extraction pressure was 35 MPa，the optimum extraction temperature was 60℃，the optimum extraction time was 2 h.Reversed phase HPLC was used to determine Astaxanthin，the chromatographic column was waters novapak C18 column(3.9 ×150 mm，5 um);methol-dichloromethane-water(50∶2∶3，V∶V∶V)was used as the mobile phase at a flow rate of 0.6 mL·min－1;the detection was performed by a UV detector at 478 nm;the linear range of the method was 10-100 μg·mL－1(R2=0.999 2);the recovery rate was 99.01%.

supercritical CO2extraction;orthogonal experiment;Astaxanthin;HPLC

Q 658 < class="emphasis_bold">文献标志码:A

A

1004－1729(2011)01－0029－04

2011－11－01

海南大学青年基金项目(qnjj1003)

周雪晴(1982－)，女，四川广安人，海南大学材料与化工学院分析测试中心，讲师.

冯玉红，海南大学材料与化工学院分析测试中心，教授.