淫羊藿苷改善糖尿病大鼠睾丸病变及其对转化生长因子β1和Ⅳ型胶原蛋白酶表达的影响*

陈 凯， 苏燕慧， 喻苏青， 刘浩然， 齐敏友△

(1 浙江工业大学药学院，浙江 杭州310014;2 湖南大学化学化工学院，湖南 长沙410082)

糖尿病是一种多代谢紊乱疾病，其并发症可涉及多种器官。糖尿病所并发的生殖功能障碍是其临床表现之一［1，2］，发病率是其他人群的5－10 倍，给患者的身心健康带来严重的伤害。随着糖尿病发病率的逐年上升，糖尿病并发的男性生殖功能损伤越来越受到社会的关注［3］，其发病机制尚未完全明了。淫羊藿苷(icariin)是小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epinedium)植物淫羊藿茎叶中提取的总黄酮(total flavonoids)的主要有效成分，分子式为C33H40O15，分子量676.67，结构上属于8－异戊烯基黄酮醇苷类化合物［4］。现代药理学研究证明，淫羊藿苷具有抗肿瘤、增强免疫功能、改善心脑血管功能、调节内分泌等多种药理学作用［5］，但对糖尿病睾丸病变的作用尚未见报道。本实验采用链脲佐菌素诱导大鼠1型糖尿病模型，研究淫羊藿苷对1 型糖尿病大鼠睾丸结构和功能的影响及其可能机制，为其临床新用途提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 动物 SD 雄性健康大鼠，体重180－200 g，(浙江医学科学院实验动物中心提供)。合格证号为SCXK(浙)2008－0033。

1.2 主要药物及试剂 淫羊藿苷由西安小草植物科技有限公司提供，淡黄色粉末，纯度98.25%;链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，Sigma 产品;考马斯亮蓝测试盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、γ－谷氨酰转肽酶(γ－glutamyl transpeptidase，γ－GT)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)试剂盒均由南京建成生物工程有限公司提供;血糖和睾酮检测试剂盒由天津九鼎生物工程有限公司提供;兔抗大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)抗体和Ⅳ型胶原蛋白(collagen Ⅳ)由武汉博士德公司提供。

1.3 主要仪器 血糖测定仪(美国强生公司);紫外分光光度计、离心机(巩义市英峪予华仪器厂);电子天平(型号104，Mettler－Toledo Group);恒温水浴箱(型号WB22);石蜡切片机(HITACHI);Image－Pro Plus 5.0 图像分析软件。

2 方法

2.1 模型建立及动物分组 雄性SD 大鼠分笼饲养，自由饮水。禁食12 h 后，于尾静脉内注射STZ，剂量为40 mg·kg－1(用0.1 mol·L－1无菌柠檬酸缓冲液配制，pH 4.6)。72 h 后抽尾静脉血测血糖，血糖＞16.7 mmol·L－1为糖尿病大鼠模型。正常组尾静脉内注射同等剂量的柠檬酸缓冲液。糖尿病大鼠随机分为正常组、模型组、淫羊藿苷组，每组10 只;于第4 周末开始灌胃，淫羊藿苷组以淫羊藿苷混悬液灌胃(混悬于0.5%羧甲基纤维素钠CMC－Na);正常组及模型组每天同体积羧甲基纤维素钠灌胃。

2.2 标本收集与处理 实验过程中各组均喂标准饮食，常规监测血糖，观察体重变化，于12 周末处死各组大鼠，心脏取血，摘取双侧睾丸，称其总质量，取其平均值(g)，与体质量之比(g)，即为睾丸质量系数(质量系数=脏器质量/体质量×100%)。右侧睾丸组织置于10%中性甲醛以制作石蜡切片，用于病理检查，左侧睾丸组织保存于液氮中。

2.3 生化指标测定 将血标本离心10 min(2 000 r·min－1)，取血清，按试剂盒说明测睾酮。取左侧睾丸组织以生理盐水制成匀浆，检测SDH、ACP、γ－GT和LDH 的活性。

2.4 组织学检测 取右侧睾丸组织以10%中性甲醛固定，沿其长轴垂直于曲细精管走向剖开，经石蜡包埋切片，HE 染色，于光镜下观察。

2.5 免疫组织化学染色 取各组大鼠睾丸组织石蜡包埋，4 μm 切片，烤片2 h，常规脱蜡至水，3%H2O2处理清除内源性过氧化物酶，抗原热修复。用正常山羊血清封闭后，分别滴加兔抗大鼠TGF－β1、Ⅳ型胶原蛋白多单克隆抗体(1∶50)4℃孵育过夜。滴加Envision 工作液(武汉博士德公司，1∶50)室温30 min。DAB 显色，镜下控制显色程度后水洗。苏木素衬染，经二甲苯透明后中性树胶封片。定量分析:在高倍显微镜下(×400)随机选取组织结构保存较好的精曲小管，用Image－Pro Plus 5.0 彩色病理图像分析软件进行分析，测定免疫组化阳性颗粒的平均吸光度值，并计算8 个视野吸光度的均值，对TGF－β1和Ⅳ型胶蛋白表达做半定量分析。

3 统计学处理

结 果

1 淫羊藿苷对血糖及睾丸质量系数的影响

模型组大鼠血糖明显高于正常组(P ＜0.01)，使用淫羊藿苷后，血糖无明显变化，见表1。模型组大鼠体重下降，睾丸质量系数增大，与正常组比较有显著差异(P ＜0.01);淫羊藿苷组大鼠体重及睾丸质量系数较模型组有所改善，睾丸质量系数明显降低(P ＜0.05)。

表1 淫羊藿苷对体重、血糖及睾丸质量系数的影响Table 1. Effects of icarrin on body weight(BW)，the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and blood glucose(±s.n=10)

表1 淫羊藿苷对体重、血糖及睾丸质量系数的影响Table 1. Effects of icarrin on body weight(BW)，the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and blood glucose(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.

Group BW(g) TW/BW(%) Glucose(mmol/L)Control 360.55±21.14 0.40±0.03 5.00±0.34 Model 165.33±11.15＊＊ 0.59±0.05＊＊ 19.85±3.07＊＊Icarrin 220.50±4.95## 0.44±0.06#16.37±3.94

2 淫羊藿苷对睾丸组织特异性酶SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睾酮水平的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠睾丸中SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睾酮水平明显下降(P＜0.01)，而淫羊藿苷组大鼠睾丸中SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睾酮水平较糖尿病有显著提高(P ＜0.01)，见表2。

表2 淫羊藿苷对睾丸组织SDH、γ－GT、ACP、LDH 活性和睾酮水平的影响Table 2. Effects of icarrin on the activitiy of SDH，γ－GT，ACP and LDH and the level of testosterone in testicular tissues(±s.n=10)

表2 淫羊藿苷对睾丸组织SDH、γ－GT、ACP、LDH 活性和睾酮水平的影响Table 2. Effects of icarrin on the activitiy of SDH，γ－GT，ACP and LDH and the level of testosterone in testicular tissues(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs diabetic.

Group SDH(U·g －1 protein)γ－GT(U·g －1 protein)ACP(U·g －1 protein)LDH(U·g －1 protein)Testosterone(nmol·L －1)Control 29.92 ±4.72 51.50 ±6.74 101.23 ±17.38 4 005.42 ±600.70 33.88 ±2.61 Model 15.51 ±2.97＊＊ 27.47 ±8.07＊＊ 63.05 ±13.30＊＊ 2 832.64 ±428.32＊＊ 17.11 ±2.12＊＊Icarrin 25.18 ±4.21## 45.15 ±3.31## 89.72 ±14.76## 3 846.64 ±589.21## 23.49 ±2.55##

3 睾丸组织形态学改变

正常组小鼠睾丸各级生精细胞丰富，生精细胞与支持细胞排列有序;模型组睾丸各级生精细胞显著减少，支持细胞少，甚至成空泡，细胞排列紊乱。淫羊藿苷组生精细胞相对模型组增多，排列较为整齐，与正常组较为接近，见图1。

Figure 1. Pathological changes of rat testicular tissues from control (A)，model (B)，icarrin (C)groups (HE staining，×100).图1 各组大鼠睾丸组织病理比较

4 睾丸组织中TGF－β1 和Ⅳ型胶原蛋白的变化

淫羊藿苷对大鼠生殖细胞TGF－β1和Ⅳ型胶原蛋白表达的观察结果见图2、3。TGF－β1和Ⅳ型胶原蛋白阳性表达主要见于圆形精子细胞以及支持细胞的胞质。与正常对照组比较，模型组表达显著增加(P ＜0.01)，淫羊藿苷组的表达与模型组比较明显降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。

讨 论

对于糖尿病及其并发症的动物模型的建立方法有多种，到目前为止，大部分对糖尿病睾丸组织病理变化的研究通常使用STZ 诱导的动物模型［6］。STZ为一种广谱抗菌素，能特异性破坏胰岛β 细胞，导致胰岛素分泌减少，血糖升高。本研究证实，经STZ 溶液(40 mg·kg－1)一次性尾静脉注射方法制备大鼠糖尿病模型［7］，模型组和用药组大鼠的血糖均＞16.7 mmol/ L，多饮、多尿、多食、少重的“三多一少”症状明显，24 h 尿量大于原尿量50%，显示本研究中糖尿病睾丸病变模型是成功的。

糖尿病导致的睾丸功能和结构的损伤可以表现为其标志性酶类的变化［8］。睾丸中标志性酶ACP其活性的高低可作为衡量是否有生精障碍的指标，SDH 在精子能量代谢中起重要作用，LDH 促进能量代谢及生精上皮成熟，而γ－GT 则为精子成熟提供酸性环境［9］。本实验研究结果显示，STZ 诱导的糖尿病大鼠功能明显损害。模型组睾丸系数显著下降，睾丸特异性酶类活性的减弱。另外，病理组织学显示曲细精管明显减少，支持细胞少，甚至成空泡。淫羊藿苷组对上述表现都有不同程度的逆转，提示淫羊藿苷可以保护酶的活性，防止各级生精细胞的损伤，促进生精细胞能量的生成，从而对糖尿病模型大鼠睾丸有保护作用。

Figure 2. Expression of TGF－β1 in testicular tissues of rats(immunohistochemical staining，×400).A:control;B:model;C:icarrin. ±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs A;##P ＜0.01 vs B.图2 睾丸组织TGF－β1 的表达

Figure 3. Expression of collagen Ⅳin testicular tissues of rats(immunohistochemical staining，×400).A:control;B:model;C:icarrin.±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs A;#P ＜0.05 vs B.图3 睾丸组织Ⅳ型胶原蛋白的表达

对生殖系统来讲，睾酮水平在刺激性器官分化、发育并维持正常性功能方面均起重要作用［10］，睾酮促使精子发生和成熟，糖尿病可以使睾丸逐步出现病变，睾酮分泌减少，本实验中糖尿病模型大鼠血清睾酮明显减少，淫羊藿苷能在一定程度上恢复睾丸功能，促进睾酮分泌，进一步证明淫羊藿苷对糖尿病及其并发的性与生殖功能障碍有防治作用。

TGF－β1是糖尿病并发症发展过程中起重要作用的一类生长因子［11］，表达于各种哺乳动物的睾丸中，与睾丸的生理功能密切相关。一些体内外研究中对糖尿病睾丸的保护药物往往以此为评价，睾丸发病过程中各种损伤介质最终是通过诱导TGF－β1增加致睾丸损害。另外，TGF－β1能诱导基质蛋白的沉积［12］，同时刺激睾丸界膜中主要的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分子Ⅳ型胶原蛋白的表达和产生［13］。Ⅳ型胶原作为ECM 的主要组分，构成睾丸基膜的结构支架，是ECM 增殖的主要成分。本研究免疫组化结果显示模型组TGF－β1及Ⅳ型胶原蛋白表达显著升高，与模型组相比，淫羊藿苷组TGF－β1及Ⅳ型胶原蛋白表达明显减少。这提示淫羊藿苷最终是通过下调TGF－β1与Ⅳ型胶原途径发挥其睾丸保护作用，但其作用机制尚有待进一步研究。

总之，本研究表明，淫羊藿苷对糖尿病大鼠睾丸具有一定的保护作用，机制可能与其促进睾酮分泌、抑制TGF－β1和Ⅳ型胶原蛋白表达有关。由于目前对糖尿病睾丸病变缺乏有效治疗手段，因此积极研究淫羊藿苷治疗糖尿病睾丸病的作用和机制具有重要意义。

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