转WMV－2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究

应奇才，徐祥彬，薛大伟，潘慧娟，王慧中

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036）

转WMV－2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究

应奇才，徐祥彬，薛大伟，潘慧娟，王慧中＊

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036）

转WMV－2CP基因甜瓜的小鼠急性和亚急性毒性试验、致突变试验以及30d喂养安全性分析试验.其小鼠经口急性毒性半致死量LD50＞90g/kg体重试验，表明该转基因食品属实际无急性毒性物质；微核实验和精子畸变实验及Ames实验均未发现有致突变作用；30d喂养试验，54、108、162g/kg体重各剂量组小鼠发育、增重、食物利用率、血常规、脏体比及病理组织学等各项指标和基础对照组比较均无显著性差异.上述结果初步表明转WMV－2CP基因甜瓜对小鼠没有毒性，属安全食品.

转基因甜瓜；WMV－2CP基因；毒性试验；致突变试验；喂养实验

甜瓜（Cucumismelo）属葫芦科，一年蔓生草本植物，原产于非洲热带沙漠地区，大约在北魏时期随着西瓜一同传到中国，明朝开始广泛种植.现在我国各地普遍栽培，果肉生食，止渴清燥，可消除口臭，但瓜蒂有毒，生食过量，即会中毒.近年来，由于病毒病的危害，品质和产量不断下降，有些地区发病率高达100%，造成较大经济损失.侵染甜瓜的病毒主要是西瓜花叶病毒2号、黄瓜花叶病毒和南瓜花叶病毒，其中WMV－2是甜瓜病毒病中发病最严重的毒源，占田间病株90%以上.随着基因工程技术的发展，将抗真菌蛋白基因转入植物来提高农作物对真菌病害的抵抗能力.王慧中等［1－2］已将WMV－2病毒的外壳蛋白基因（WMV－2CP）导入华南108甜瓜培育出甜瓜抗病新品种.攻毒试验表明，转基因的甜瓜对毒源有很强的抗性；田间试种发现与未转基因对照相比，转基因株系较非转基因推迟WMV－2病毒发病时间，减轻发病程度，显著减轻了病毒病造成的损失，具有良好的推广价值.

自20世纪90年代中期抗除草剂转基因作物产业化以来，在政治家、社会活动家和消费者中间，特别是在欧洲，对转基因食品的安全性忧虑不断增多.同样，转WMV－2CP基因甜瓜食品是否安全也须科学评估，故本实验室在参考药物、食品添加剂的健康安全性评价的基础上［3－4］，对转WMV－2CP基因华南108甜瓜进行了毒性试验、致突变试验和小鼠30d喂养试验，获取了一些有效的实验数据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用ICR小鼠由杭州师范大学实验动物中心提供.

转WMV－2CP基因甜瓜、未转基因华南108甜瓜由杭州师范大学生物化学与分子生物学重点实验室提供，实验前去皮去子，打成匀浆.

菌株TA97、TA98、TA100、TA102由上海市劳动卫生与职业病防治研究所提供，生物学鉴定合格.

1.2 急性毒性试验

选健康、成年、体重20g左右ICR小鼠40只，雌雄各半.随机分90g/kg体重转WMV－2CP基因甜瓜剂量组和阴性对照组，每组20只，雌雄各半.取转WMV－2CP基因甜瓜匀浆，24h内灌胃分2次进行，而后连续观察10d.10d后处死小鼠，观察小鼠的肝、肾、脾、胸腺等脏器的形态特征.

1.3 亚急性毒性试验

选健康、成年、体重25g左右ICR小鼠40只，雌雄各半.随机分转WMV－2CP基因甜瓜组和阴性对照组，每组20只，雌雄各半.取转WMV－2CP基因甜瓜匀浆，每天灌胃1次，每次30g/kg体重，连续灌胃14d，然后观察10d.10d后处死小鼠，观察小鼠的肝、肾、脾、胸腺等脏器的形态特征.

1.4 致突变试验

方法参照《实用毒理学手册》［5］.

1.4.1 微核试验

选健康、成年、体重25g左右ICR小鼠160只，雌雄各半.小鼠随机分15、30、60g/kg体重3个转WMV－2CP基因甜瓜剂量组，15、30、60g/kg体重3个正常甜瓜剂量组，一个阴性组（水）和一个阳性对照组（环磷酰胺80mg/kg体重），每组20只，雌雄各半.小鼠间隔24h连续灌胃2次，第2次灌胃后6h处死.取胸骨骨髓制成骨髓片，Gimsa染色.每只小鼠记数嗜多染红细胞1 000只，计算微核率.

1.4.2 精子畸变试验

选取健康、成年、体重25g左右雄性ICR小鼠80只，小鼠随机分15、30、60g/kg体重3个转WMV－2CP基因甜瓜剂量组，15、30、60g/kg体重3个正常甜瓜剂量组，一个阴性对照组（水）和一个阳性对照组（丝裂霉素C 0.004mg/kg体重），每组10只.小鼠分别用转WMV－2CP基因甜瓜匀浆及对照甜瓜匀浆连续灌胃30d，最后一次灌胃24h后处死，分别取两侧附睾，制成吸滤液直接涂片，伊红染色，高倍镜下观察精子形态并计数，每只小鼠计数完整精子1 000条，计算精子畸形发生率.

1.4.3 Ames试验

试验菌株采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97、TA98（移码型突变株）和TA100、TA102（碱基置换型突变株）.转WMV－2CP基因甜瓜匀浆过筛200目，用TA100菌株的非代谢活性系统进行预试，结果在剂量为15 000μg/皿时未出现明显的抑菌或增菌现象，正式试验时选择试验浓度为20 000、15 000、10 000、5 000、1 000、250μg/皿6个转WMV－2CP基因甜瓜剂量组，外加阴性对照和阳性对照.采用标准平板掺入法，需要代谢活化时加入用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活化系统，37℃培养箱孵育48h，计数回变菌落数.实验重复3次.

1.5 小鼠30d喂养试验

选取健康、成年、体重18～22g ICR小鼠140只，雌雄各半，小鼠随机分54、108、162g/kg体重3个转WMV－2CP基因甜瓜剂量组（A），54、108、162g/kg体重3个正常甜瓜剂量组（B），另设一个基础对照组（基础饲料），基础饲料含热能1.73kJ/kg，水分7.43%，粗蛋白22.64%，粗脂肪4.85%，粗纤维3.35%，粗灰分6.97%，钙1.33%，磷0.76%，食盐0.55%，无氮浸出物55.63%，每组10只，雌雄各半.

基础饲料配方：麦粉18%、面粉18%、黄豆粉18%、玉米粉18%、米粉18%、鱼粉8%、骨粉1%、酵母粉1%；36g/kg体重转WMV－2CP基因甜瓜剂量组饲料配方：基础饲料配方中的18%米粉用转WMV－2CP基因甜瓜匀浆（甜瓜匀浆中平均含水80%～85%，18%米粉用3倍的甜瓜匀浆配制后烘干）代替；72g/kg体重转WMV－2CP基因甜瓜剂量组饲料配方：基础饲料配方中的18%米粉及18%面粉用3倍的转WMV－2CP基因甜瓜匀浆代替；108g/kg体重转WMV－2CP基因甜瓜剂量组饲料配方：基础饲料配方中的18%米粉、18%面粉和18%玉米粉用3倍的转WMV－2CP基因甜瓜匀浆代替；36、72、108g/kg体重3个正常甜瓜剂量组饲料配方同于转WMV－2CP基因甜瓜剂量组饲料配方，只是用正常甜瓜匀浆代替转WMV－2CP基因甜瓜匀浆.

小鼠2只每笼饲养，自由进食饮水，饲料配比为体重的10%.连续观察30d，每周记录体重和进食量并计算食物利用率，实验结束时断头取血、处死，对每只小鼠进行脏器大体观察，同时取肝、肾称重并计算脏体比，对血进行血象、血生化检查.

取肝、肾、胃、肠组织分别固定在10%的福尔马林中，石蜡包埋，间断连续切片，切片厚5μm，HE染色，对照组和实验组的切片同时进行染色，然后光学显微镜下观察对比.

检验组织损伤判别标准：正常组织为“－”，变形的组织按损伤程度的轻与重分成为“＋”和“＋＋”二个等级.

1.6 统计学方法

各组计量资料以x±s表示，数据处理采用DPS3.01中文数据统计软件进行方差分析和单因素多重比较.以P＜0.01表示显著性差异.

2 结 果

2.1 急性毒性试验结果

喂养期间，所有小鼠均未见明显症状，没有死亡；观察小鼠的肝、肾、脾、胸腺等脏器均无异常变化，病理检查各脏器均无异常改变，证明转WMV－2CP基因甜瓜对雌雄小鼠经口LD50均大于90g/kg体重，说明毒性极微或没有毒性.

2.2 亚急性毒性试验结果

喂养期间，所有小鼠均未见明显症状，没有死亡；观察小鼠的肝、肾、脾、胸腺等脏器均无异常变化，病理检查各脏器均无异常改变，证明转WMV－2CP基因甜瓜毒性极低或没有毒性，对小鼠来说食用是安全的.

2.3 致突变试验结果

2.3.1 微核试验结果

转WMV－2CP基因甜瓜和正常甜瓜对小鼠微核率的影响见表1.

表1 转基因和正常甜瓜对小鼠微核率的影响Tab.1 Effect of transgenic Cucumis melo on micronucleirate of mice

雌雄各剂量组（包括转WMV－2CP基因甜瓜各剂量组和正常甜瓜各剂量组）与阴性对照组之间的微千分率经t检验，P均＞0.05，显示微千分率在雌雄各剂量组与阴性对照组之间无显著性差异；阳性对照组的微千分率显著高于阴性对照组，经t检验，P＜0.01，显示其差异有非常显著性意义.表明转WMV－2CP基因甜瓜对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率未见明显影响，检测结果显阴性.

2.3.2 小鼠精子畸形试验结果

转WMV－2CP基因甜瓜和正常甜瓜对小鼠精子畸形发生率的影响见表2.各转WMV－2CP基因甜瓜剂量组与阴性对照组之间的精子畸形发生率经t检验，P＞0.05，显示小鼠精子畸形发生率在各转WMV－2CP基因甜瓜剂量组和阴性对照组之间均无显著性差异；各转WMV－2CP基因甜瓜剂量组与相应正常甜瓜对照组之间的精子畸形发生率经t检验，P均＞0.05，显示小鼠精子畸形发生率在转WMV－2CP基因甜瓜各剂量组与相应正常甜瓜对照组之间均无显著性差异；阳性对照组与阴性对照组之间，经t检验，P均＜0.01，显示阳性对照组与阴性对照组之间达显著性差异.转基因甜瓜检测结果为阴性.

表2 转基因甜瓜对小鼠精子畸形发生率的影响Tab.2 Effect of transgenic watermelon on aberrant sperms rate of mice

2.3.3 Ames试验结果

各菌落回变菌落数结果如表3所示.从表3可知，不同浓度受试物在加和不加S9条件下的回变菌落与阴性对照组相近，阳性对照回变菌落数高于阴性对照回变菌落数2倍以上.转基因西瓜Ames试验检测结果为阴性.

2.4 小鼠30d喂养试验结果

结果如表4所示，试验期间小鼠生长良好，无异常征状和体征，也无死亡；血常规检查显示白细胞、血色素均在正常范围内；生化指标（谷丙转氨酶、血清总蛋白、清蛋白、尿素氮、血糖）均在正常范围内［6］；解剖时大体观察未见异常，脏器系数各剂量组与阴性对照组比较无显著性差异.

2.5 组织病理学观察结果

在光学显微镜下观察对照组和各剂量组小鼠的肝、肾、胃肠均未见有意义的病理改变（表5）.

表3 转基因甜瓜Ames试验检测结果Tab.3 Results of Ames test of transgenic Cucumis melo

表4 转基因甜瓜对小鼠增重、食物利用率及血生化指标的测定Tab.4 Effect of transgenic Cucumis melo on weight food utilization rate and blood components of Mice

表5 转基因甜瓜对小鼠脏器的影响Tab.5 Effect of transgenic Cucumis melo on viscera of Mice

3 讨 论

转基因食品（genetically modified food，GM food）是指利用基因工程技术改造基因组构成的食品［7］，为解决粮食短缺、资源匮乏、环境污染等问题提供了契机.

转基因食品在给人类带来巨大利益的同时，也给人类健康和环境安全带来潜在的风险.自斑蝶事件［8－9］报道以来，引起了人们的极大关注.因此，转基因食品的安全管理受到了世界各国的重视，其安全性评价是安全管理的核心和基础之一.其中，转基因食品的毒理学评价，如免疫毒性、神经毒性、致癌性、繁殖毒性以及是否有过敏源等是安全性评价的重要内容之一［10］.

当前转基因食品的安全性评价主要集中在水稻、玉米等粮食作物上，转基因甜瓜的安全性评价还未见报道.通过对小鼠的急性毒性实验、微核实验、精子畸变实验及Ames实验发现，转抗除草剂基因（bar）水稻属实际毒性极微或无毒类物质，表明转bar基因水稻对小鼠是安全的［11］.同样在转耐盐基因水稻和西瓜中也得到相似结果［12－14］.但是据Finamore等［15］研究报告，在食用含50%转基因玉米（Mon810）饲料后，断奶幼鼠（出生21d）和成年鼠（出生18～19个月）的肠和外周免疫反应出现了异常.其中，断奶幼鼠在连续30d食用含转基因玉米饲料后，淋巴细胞、脾和血淋巴细胞的免疫表型都出现异常.成年鼠也在连续90d食用含转基因玉米的饲料后，淋巴细胞和血淋巴细胞的免疫表型也出现异常，这意味表明转基因玉米食品也可能会给人类健康带来不良影响.因此对转基因食品的商业化审批必须谨慎，同时应加强对转基因食品安全性评价的研究.

通过转WMV－2CP基因甜瓜对小鼠的急性毒性试验、亚急性毒性试验、致突变试验和小鼠30d喂养试验的结果表明，转WMV－2CP基因甜瓜对成年小鼠来说食用是安全的.该研究结果只是一个初步结论，还需要对断奶幼鼠、成年鼠及连续多代食用转WMV－2CP基因甜瓜安全性作进一步的研究.

其实，转基因作物最大的危害是对作物本身.由于转基因技术的发展，各种优势基因都可以非常容易地转到目标作物上，这对植物的多态性是一种伤害.而且，如果人类对植物的多态性保护不够，这种伤害是不可逆的.

［1］王慧中，李亚南，赵培洁.根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生［J］.浙江大学学报：农业与生命科学版，2000，26（3）：287－290.

［2］王慧中，赵培洁，周晓云.转基因甜瓜植株的获得及其抗病性［J］.植物保护学报，2000，27（2）：126－130.

［3］WHO.Health aspects of marker genes in genetically modified plants.［C］//Raport of a WHO Workshop，Greneva：1993.

［4］贾士荣.转基因植物的环境及食品安全性［J］.生物工程进展，1997，1（6）：37－42.

［5］纪云晶.实用毒理学手册［M］.北京：中国环境科学出版社，1991：93－121.

［6］涂新明，木内吉宽.无菌ICR小鼠和普通ICR小鼠血液中生化正常值的测定和比较［J］.中国实验动物学杂志，1996，6（2）：91－93.

［7］樊龙江，周雪平.转基因作物安全性争论与事实［M］.北京：中国农业出版社，2001：1－2.

［8］Ewen S，Pustai A.Effect of diets containing genetically modified potatoes expressing Galanthus nivalis lectin on rat small intestine［J］.Lancet，1999，354（9187）：1353－1354.

［9］Losey J E，Rayor L S，Carter M E.Transgenic pollen harms monarch larvae［J］.Nature，1999，399（6733）：214.

［10］邓平建.农业转基因生物食用安全性要示与评价［M］.北京：人民卫生出版社，2008：46－63.

［11］薛大伟，马丽莲，姜华，等.抗除草剂转基因水稻的安全性评价［J］.农业生物技术学报，2005，13（6）：723－727.

［12］陈河，王慧中，赵文华，等.转mtlD/gutD基因稻米对大鼠性腺毒性的实验研究［J］.中国水稻科学，2007，21（4）：341－344.

［13］王慧中，应奇才，钟国庆，等.转mtlD/gutD双价基因稻米对大鼠的毒性试验［J］.中国水稻科学，2004.18（3）：208－212.

［14］应奇才，薛大伟，徐祥彬，等.转WMV22CP基因西瓜的安全性评价［J］.浙江农业科学，2009（5）：966－970.

［15］Finamore A，Roselli M，Britti S，etal.Intestinal and peripheral immune response to MON810maize ingestion in weaning and old mice［J］.J Agric Food Chem，2008，56（23）：11533－11539.

Safety Assessment of Transgenic Cucumis Melo withWMV－2CPGene

YING Qi－cai，XUE Da－wei，XU Xiang－bin，PAN Hui－juan，WANG Hui－zhong

（College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

Safety assessment of virus－resistant transgenic Cucumis melo was carried out.Toxicity experiments，mutation experiments，and 30－d feeding test were conducted on mice with transgenic Cucumis melo bearingWMV－2CPgene.The results show that oral LD50for mice is larger than 90g/kg so that the transgenic Cucumis melo belongs to nontoxic food.No mutation is found in micronucleus test，spermium aberration test or Ames test.The mice groups with 54，108，162g/kgdosage have good development in 30－day feeding test.No obvious differences are found in the index of weight，food utilization rate，routine blood test，rate of organ to body（weight to weight），and patho－histological observations between mice fed with or without the transgenic Cucumis melo.It shows that transgenic watermelon withWMV－1CPgene is safe to mice.

transgenic Cucumis melo；WMV－2CPgene；toxicity experiment；mutation experiment；feeding test

S651

A

1674－232X（2011）05－0422－07

10.3969/j.issn.1674－232X.2011.05.008

2011－01－26

浙江省自然科学基金项目（393105）；钱江人才计划资助项目.

应奇才（1965—），男，浙江永康人，高级实验师，主要从事生物化学与免疫学研究.E－mail：yingqicai＠163.com＊

王慧中（1962—），男，浙江义乌人，教授，博士，主要从事植物分子生物学研究.E－mail：whz62＠163.com