一株鱼溃疡致病菌的分离及鉴定

胡健饶，章丽梅，史雨红，陈 炯

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波 315211）

胡健饶1，章丽梅1，史雨红2，陈 炯2

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波 315211）

该研究从宁波市象山港鱼养殖区患病鱼肾脏中分离到1株优势菌Mm041，人工回感试验确定该菌株为致病菌株，测定其对鱼的半致死量为3.0×106CFU.通过形态学观察、生理生化特征鉴定，并结合细菌16SrRNA基因序列同源性和系统发育分析，确定Mm041为美人鱼发光杆菌.药敏试验结果表明，该菌株对氯霉素、羧苄青霉素、头孢哌酮（先锋必）高度敏感.

鱼；美人鱼发光杆菌；鉴定

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌EscherichiacoliTG1由该试验保存，T4DNA连接酶、pMD19－T Simple Vector和Ex Taq DNA聚合酶均购自Takara公司，Gel Extraction Kit购自北京百泰克生物技术有限公司，Plasmid MiniKit购自Omega公司.细菌鉴定管和药敏纸片购自杭州天河微生物试剂有限公司.引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成.

1.2 病原菌的分离

1.3 病原菌的人工回感试验和半致死量测定

将菌株Mm041接种于普通营养肉汤培养基中，于28℃过夜培养，用0.9%的灭菌生理盐水洗涤菌体，经平板菌落计数法确定菌悬液浓度为3.0×109CFU/mL，10倍梯度稀释后备用.试验共分6个组（5个试验组和1个对照组），每组12尾鱼，试验水温为（20±1）℃.驯养7d后，试验组每尾鱼分别腹腔注射0.1mL10倍梯度稀释的菌悬液，对照组每尾腹腔注射等剂量的灭菌生理盐水.注射后每日观察试验鱼的发病症状和死亡情况，并对死亡鱼体进行解剖和病原菌的再分离.采用Aliu和Nwude［2］改进的寇氏法计算Mm041在20℃左右时对平均体重约150g鱼的半致死量：lgLD50＝Xk－d（∑Pi－0.5），其中Xk为最大剂量对数，d为相邻两组对数剂量之差数，Pi为死亡率，i为组号.

1.4 病原菌体形态观察

观察菌株Mm041在普通营养琼脂和TCBS平板上菌落的形态特征，并取纯培养物制备相应的涂片，革兰氏染色后于普通光镜下观察菌体的形态和大小.对Mm041进行磷钨酸负染，晾干后，透射电镜观察其个体形态、大小和鞭毛结构等.

1.5 生理生化特征鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》［3］和《伯杰氏细菌学鉴定手册》［4］中的形态学和生理生化指标，对分离菌株Mm041进行鉴定.

1.6 16S rRNA基因的扩增、测序和分析

1.6.1 基因组DNA提取和PCR扩增

采用已报道的细菌16SrRNA基因通用扩增引物［5］进行PCR扩增.采用Wilson［6］所描述的方法提取分离菌株的基因组DNA.PCR反应体系为：基因组DNA 0.5μL，10×Ex Taq PCR缓冲液（含MgCl2）2.5μL，dNTP混合物（各2.5mol/L）2μL，上下游引物（10pmol/L）各1μL和Ex Taq DNA聚合酶1 U，补充灭菌水至总体积25μL.PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min.

1.6.2 扩增产物的克隆和测序

1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的条带后，将纯化后的PCR产物克隆至pMD19－－T Simple Vector，并转化E.coliTG1，经蓝白斑筛选后抽提质粒，PCR扩增鉴定获得阳性克隆.阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司进行测序.

1.6.3 序列分析

将获得的16SrRNA基因序列进行BLAST分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/），选取10株与Mm041同源性相似的细菌16SrRNA基因序列，采用ClustalW软件（http：//clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）对Mm041与10株细菌16SrRNA基因序列进行多重序列比对分析，采用MEGA 4.0软件（Neighborjoining法）构建系统发育进化树.

1.7 药物敏感性试验

取100μL Mm041菌悬液（3×109CFU/mL）涂布于普通营养琼脂平板，用灭菌镊子分别取药敏纸片贴于培养基表面，28℃恒温培养16～18h，测定抑菌圈直径大小，根据说明书标准判断Mm041对各类抗生素的敏感性和抗药性.

2 结 果

2.1 分离菌株的致病性

2.2 菌体的形态及生理生化特征

供试纯培养菌菌株Mm041的形态特征为革兰氏阴性，在镜下可见菌体粗短、两端钝圆、呈杆状、多单个散在和个别成双排列的革兰氏阴性菌.大小多在（0.6～1.0）×（1.0～2.0）μm的杆菌（见图1）.可运动，经透射电镜观察，绝大多数菌体具一根长的极生单鞭毛（见图1）.将Mm041在普通营养琼脂平板上28℃培养24h后，菌落呈圆形，半透明，直径约1.5mm，边缘整齐，中央隆起，表面光滑湿润.在TCBS琼脂平板上能生长，菌落呈绿色，菌落圆形光滑、边缘整齐、较隆起.

生理生化特征鉴定结果见表1.Mm041为氧化酶、接触酶、脲酶等阳性；V－P试验和靛基质试验阴性、鸟氨酸脱羧酶阴性；利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖等，且发酵葡萄糖，产酸不产气；对弧菌抑制剂O/129（2，4－二氨基－6，7－二异丙基喋啶磷酸盐）（150μg或10μg）敏感.参考《常见细菌系统鉴定手册》［3］和《伯杰氏细菌学鉴定手册》［4］，菌株Mm041生化特征与美人鱼发光杆菌最为接近.

图1 菌株Mm041的透射电镜照片（15000 x）Fig.1 The transmission electron microscope image of the strain Mm041（15000x）

表1 Mm041分离菌的理化特性Tab.1 Physiological and chemical characteristics of the isolated strain Mm041

2.3 细菌16SrDNA扩增及序列分析

以菌株Mm041的基因组DNA为模板，采用已报道的细菌16SrRNA基因通用扩增引物进行PCR扩增，目的片段克隆后测序，其16SrRNA基因序列EMBL登录号为FR687000.

细菌16SrRNA基因核苷酸序列比较分析表明，Mm041与美人鱼发光杆菌核苷酸序列同源性最高，为98.8%～99.6%，与其它发光杆菌属成员同源性分别为94.7%～96.8%，与弧菌属成员为92.4%～95.1%.16SrRNA基因系统进化树分析表明，Mm041与美人鱼发光杆菌系统进化相关性最高，与同属的其它成员进化相关性次之，与同科的弧菌属成员进化相关性较远，但与同属其他成员进化相关性较远（图2），说明菌株Mm041为美人鱼发光杆菌（即原弧菌属的美人鱼弧菌）的一个分离物.

图2 基于部分弧菌科成员16SrRNA基因序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the nucleotide sequences of 16SrRNA genes from some bacterias of Vibrionaceae

2.4 药物敏感性

在所测试的10种抗菌药物中，Mm041对新生霉素、四环素、氨苄青霉素（氨苄西林）、青霉素G、先锋霉素V（头孢唑啉）等5种药物均具有耐药性，对链霉素和丁胺卡那霉素中毒敏感，而对氯霉素、羧苄青霉素、头孢哌酮（先锋必）高度敏感.

3 讨 论

美人鱼发光杆菌包括美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（P.damselaesubsp.damselae）（即原来的美人鱼弧菌）和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（P.damselaesubsp.piscicida）两个亚种.广泛存在于海水及海产动物中.1981年Love等［7］首次从患皮肤溃疡病的少女鱼病灶处分离到了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种，即海鱼弧菌.目前，已报道美人鱼发光杆菌感染皮革龟（Dermochelyscoriacea，leatherback turtles）［8］、樽鼻海豚（Tursiopstruncates，bottlenose dolphins）［9］、五条（Seriolaquinqueradiata，yellowtail）［10］、金头鲷（Sparusaurata，gilthead sea bream）［11］、大菱鲆（Scophthalmusmaximus，turbot）［12］、澳洲龙鱼（Lates calcarifer，barramundi）［13］等.此外，从患病虾、蟹和鳖中也分离到美人鱼发光杆菌［14－16］.可以引起多种海水鱼的败血病，也可以感染人体，能致人伤口感染，引起感染性腹泻［17］.

文章综合形态学、生理生化特征和16SrRNA基因系统发育分析，表明分离到的Mm041菌株为美人鱼发光杆菌的一个分离物，进一步证明了美人鱼发光杆菌具有广泛的致病性.此外，该分离物对新生霉素、四环素、氨苄青霉素（氨苄西林）、青霉素G和先锋霉素V（头孢唑啉）耐药，而对氯霉素、羧苄青霉素和头孢哌酮（先锋必）高度敏感，与其他作者分离到的美人鱼发光杆菌药敏感性略有差异［16，18］，这可能由于养殖户频繁使用各类抗生素，导致细菌变异对部分药物产生耐药性.因此在用药进行病害防治时，最好能对分离菌株进行药物敏感性检测后再选择合适药物进行治疗.

［2］Aliu Y O，Nwude N.Determination of the median lethal dose（LD50）［M］//Aliu Y O，Nwude N.Veterinary Pharmacology and Toxicology Experiments.Section 1.Zaria：Ahmadu Bello University Press，1982：104－110.

［3］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：353－398.

［4］Baumann P，Schubert R H W.Facultatively anaerobic gram－negative rods，Family II.Vibrionaceae.Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.Section 5［M］.Baltimore：Williams ＆Wilkins，1984：516－550.

［5］Acinas S G，Rodríguez－Valera F，Pedrós－AlióC.Spatial and temporal variation as shown by RFLP fingerprinting of PCR amplified 16S rDNA［J］.FEMS Microbiology Ecology，1997，24：27－40.

［6］Wilson K.Preparation of genomic DNA from bacteria［M］//Ausubel F M，Brent R，Kingston R E，etal.Current protocols in molecular biology.Section 2.4.New York：Greene Publishing Associates and Wiley－Interscience，1994：241－242.

［7］Love M，Fisher D T，Hose J E，etal.Vibrio damsela，as a marine bacterium，causes skin ulcers on the damselfish Chromis punctipinnis［J］.Science，1981，214：1140－1141.

［8］Obendorf D L，Carson J，McManus T J.Vibrio damsela infection in a stranded leatherback turtle（Dermochelys coriacea）［J］.Journal of Wildlife Diseases，1987，23：666－668.

［9］Fujioka R S，Greco S B，Cates M B，etal.Vibrio damsela from wounds in bottlenose dolphins Tursiops truncatus［J］.Disease of A－quatic Organisms，1988，4：1－8.

［10］Sakata T，Matsuura M，Shimokawa Y.Characteristics of Vibrio damsela isolated from diseased yellowtail（Seriola quinqueradiata）［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1989，55：135－141.

［11］Vera P，Navas J L，Fouz B.First isolation of Vibrio damsela from seabream（Sparus aurata）［J］.Bull Eur Assoc Fish Pathol，1991，11：112－113.

［12］Fouz B，Larsen J L，Toranzo A E.Vibrio damsela as a pathogenic agent causing mortality in cultured turbot（Scophthalmus maximus）［J］.Bulletin of the European Association of Fish Pathologists，1991，11：80－81.

［13］Renault T，Haffner P，Malfondet C，etal.Vibrio damsela as a pathogenic agent causing mortalities in cultured sea bass（Lates calcarifer）［J］.Bulletin of the European Association of Fish Pathologists，1994，14：117－119.

［14］陈拱立，刘添才.首次从长毛对虾中检出海鱼弧菌［J］.中国公共卫生学报，1991，10（2）：72－74.

［15］叶巧真，何建国，邱德金，等.中华鳖白底板病和红底板病细菌的分离鉴定及致病性［J］.微生物学通报，2000，27（6）：407－413.

［16］石亚素，童国忠，顾松叶.三疣梭子蟹中美人鱼发光杆菌的分离鉴定［J］.中国卫生检验杂志，2004，14（4）：476.

［17］温来欣，苏东，刘军.肠道门诊中病原性弧菌的分离鉴定及流行病学调查［J］.中华流行病学杂志，2002，23（6）：476.

［18］张晓君，秦国民，陈翠珍，等.龙胆石斑鱼源美人鱼发光杆菌的生物学特性与系统发育学分析［J］.渔业科学进展，2009，30（3）：38－43.

Isolation and Identification of A Pathogenic Bacterium Causing Ulcer Disease of Miiuy Croaker（MiichthysMiiuy）

HU Jian－rao1，ZHANG Li－mei1，SHI Yu－hong2，CHEN Jiong2

（1.College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；
2.Ministry of Education Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The experment islated，a dominant bacterial species，termed as Mm041from the kidney of a diseased miiuy croaker（Miichthysmiiuy）.By artificial infection tests，Mm041was characterized to be the pathogenic bacterium causing ulcer disease of miiuy croaker，and its LD50was 3.0×106CFU.Based on the biological characteristics and 16srRNA sequence analysis，Mm041was classified as an isolate ofPhotobacteriumdamselae.The result of the antibiotic sensitivity test show that Mm041is highly sensitive to chloramphenicol，carbenicillin and cefoperazone.

Miichthysmiiuy；Photobacteriumdamselae；identification

S943

A

1674－232X（2011）05－0444－05

10.3969/j.issn.1674－232X.2011.05.011

2010－03－20

浙江省科技厅科研计划项目（2009C32059；2010C32090）.

胡健饶（1967—），男，浙江萧山人，副教授，博士，主要从事动物生理学研究.E－mail：hujianrao＠126.com