芯片上的流动注射分析

徐春秀

（韩山师范学院化学系，广东潮州 521041）

芯片上的流动注射分析

徐春秀

（韩山师范学院化学系，广东潮州 521041）

流动注射分析（Flow injection analysis,FIA）打破了分析化学必须在物理化学平衡条件下进行的传统，具有广泛的适应性、高效率、低消耗、重现性好及自动化程度高等优点．目前异军突起的微型全分析系统为流动注射分析理论与技术的发展注入了新的动力．本文总结了十余年来在微流控分析芯片上进行流动注射分析操作的方法与技术，对各种方法的优缺点进行了比较和分析．

微流控芯片；流动注射分析；微型全分析系统

流动注射分析是指“将一定体积的试样溶液注射到载流溶液中，试样区带在流动的载流中经过受控制的分散，由流通式检测器检测其连续变化的物理或化学信号的方法”[1]．流动注射分析方法具有适应性广、效率高、消耗低、重现性好、自动化程度高等优点．自Ruzicka和Hansen[2]在1975年首次提出后，流动注射分析立刻引起了世界上分析化学家的广泛关注，目前关于流动注射分析的理论日益完善，与各种分离分析技术的联用已非常成熟．流动注射分析法因其摆脱了几百年来分析化学反应必须在物理化学平衡条件下完成的传统，在分析化学的发展史上占有重要地位.

20世纪90年代，异军突起的微型全分析系统（miniaturized total analysis system,μTAS）成为分析化学领域广受瞩目的焦点，引发了分析化学的又一次巨大变革．微型全分析系统由Manz和Widmer[3]于上世纪90年代初提出，目标是将分析化学实验室的多个功能单元如样品引入、预处理、反应、分离与检测等集成在一枚数平方厘米大小的微芯片上，实现分析系统的微型化、集成化、便携化与自动化.微流控芯片具有极高的分离分析效率（数秒至数十秒内完成分离、测定或其他更复杂的操作）、极低的样品与试剂消耗（样品与试剂消耗可降至纳升至皮升）等优越性．但是，微流控芯片分析中的进样量仅为纳升至皮升，与外部微升至毫升级的宏观系统之间的衔接是微流控芯片分析面临的一大挑战．其次，在微流控芯片分析中进行快速、高效的换样操作仍旧是具有较高的难度，这大大限制了微流控芯片的高速、高效的潜力[4]．微流控分析芯片存在的诸多问题和挑战为流动注射在微流控芯片分析领域的发展提供了机会．针对以上问题，学者们提出了多种在微流控芯片上进行流动注射操作的方法，目前报道的主要有外接常规泵阀的方法、电渗驱动的方法、芯片上集成微泵微阀的方法、基于取样探针的方法、基于液滴注射的方法等.

1 基于微流控芯片的流动注射分析

1.1 外接常规流动注射泵阀的方法

2002年，方群等[5]用常规流动注射蠕动泵将宏观体系中的样品引入一自制的溢流式芯片接口，在样品池接口与样品废液池之间施加电压使样品流向废液池，然后在缓冲液池和缓冲废液池之间施加电压使通道交叉口的样品引入至分离通道进行电泳分离．该系统用于氨基酸样品的分离分析，分析速度可达40-80样/小时．黄艳贞等[6]又结合蠕动泵和重力驱动的方法，采用流动注射的模式实现了快速换样操作．如图1[6]所示，芯片垂直放置，利用芯片上储液池和废液池之间的液位差，使发光试剂鲁米诺与铁氰化钾流入芯片通道汇合，过氧化氢样品则通过蠕动泵驱动使其流入芯片通道与鲁米诺与铁氰化钾的混合物汇合反应后经光子计数器检测．

2007年，Amatatongchai等[7]采用外接注射泵与切换阀的方法实现了基于微流控芯片的流动注射化学发光分析．如图2[7]所示，过氧化物酶、染料和催化剂等混合物与过氧化氢由外接注射泵驱动连续引入芯片微通道，抗氧化剂样品由一个50μL外接切换阀定量注射引入，反应产物由倒置荧光显微镜检测．

1.2 电渗驱动流动注射分析

外接常规流动注射分析蠕动泵或注射泵和阀进行芯片分析系统的流动注射操作具有换样操作快、分析通量高等优点，但是微升至毫升级的外部宏观系统与纳升至皮升级的微观芯片分析系统的衔接常导致死体积和样品消耗量过大的问题，体积庞大的泵阀也给微流控芯片分析系统的集成化和微型化带来困难．采用电渗驱动的方法则可在芯片上实现无泵无阀的流动注射操作[8-15].

自1995年开始，Haswell研究组报道了一系列采用电渗驱动在微流控芯片上进行流动注射操作的方法[8-11]．如图3[11]所示，在试剂池（R）和废液池（W）之间施加电压30 s，试剂由试剂池流向废液池并充满主通道，然后在样品池（S）和废液池（W）之间施加电压，样品池中的样品注射进入主通道试剂溶液中，最后在试剂池（R）和废液池（W）之间施加电压将样品区带推至检测器检测.Ramsey[12]研究组利用电渗驱动芯片流动注射的方法研究了0-200 nmol/L的Tarine对乙酰胆碱酯酶的抑制分析.

图1 结合蠕动泵和重力驱动的FIA系统

图2 芯片FIA系统流路与芯片实物

图3 电渗驱动FIA分析示意图

电渗驱动流动注射的优点是使用高压电源系统实现液流的操控，无需外置泵阀，有利于微流控芯片分析系统的微型化与便携化，但是电渗驱动易导致电动进样过程中的歧视效应.

1.3 打破流体驱动力平衡-从层流到注射

在芯片流动注射分析发展过程中，有学者报道了一种采用改变流体驱动力实现流动注射分析的方法.2007年，Moehlenbrock等[16]使用两个常规的微量注射泵将试剂和样品输入芯片通道，试剂和样品在微通道内以层流状态流动并流入各自废液池．装样时，将六通阀由装样调为注样状态，试剂流驱动力降低，部分样品流向试剂通道．注样时，将六通阀由注样调回装样状态，试剂溶液与样品溶液维持层流流向各自废液池完成样品注射，见图4[16]．这种方法的主要缺点是需要昂贵的泵阀系统，不利于普及．Huang等[17]在此基础上作出改进，提出了一种重力驱动的无泵无阀芯片流动注射分析系统.如图5所示，芯片垂直放置，试剂由试剂池与试剂废液池之间的液位差驱动，样品则由样品池与试剂废液池之间的液位差驱动．本系统的流动注射分析操作分三步进行，第一步，控制废液池高度使样品和试剂流向各自的废液池．第二步，增加样品废液池的高度使样品池与样品废液池之间的液位差降低，部分样品流向试剂通道．第三步，降低样品废液池的高度使其与第一步时高度相同，样品和试剂重新流向各自废液池，试剂与流入试剂通道的样品混合.该系统用重力（液位差）作为试样注射、试样与试剂混合、传输和反应的驱动力，只需要控制样品废液池的移动就能实现芯片上简单有效的门式进样，采用芯片上液芯波导光度检测系统及光电二极管实现高灵敏光度检测.系统具有结构简单、易于操作、集成化程度高、加工价格便宜、利于普及等优点.

图4 使用泵阀改变流体压力的流动注射

图5 重力驱动无泵无阀芯片流动注射分析系统

1.4 基于集成微泵微阀的流动注射分析

随着微加工技术的发展，在芯片上加工集成微泵微阀进行流动注射分析成为可能.2003年，Leach等[18]将蠕动泵、采样阀、混合/反应通道、试样选择、流通检测池等FIA系统的主要部件加工集成在一枚聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上，见图6[18]．流动注射的装样和注样操作如图7所示．采样环由两个入口和两个出口组成并与流体通道相通，两组阀共同控制阀的装样和注样过程．装样时（7a，b）[18]，关闭一组阀，样品流入采样环，载流流入混合反应通道．注样时（图7c，d）[18]两组阀的开闭状态与装样时相反，载流将采样环内的样品注射进入混合反应通道，本系统采样体积仅为1.5 nL．该系统成功的用于碱性磷酸酯酶的分析．2009年，Jambovane等[19]在PDMS芯片上大规模集成微泵微阀进行多个平行的流动注射分析操作．该芯片上集成了样品量取、混合/反应等多个功能，单次操作即可同时生成11种不同浓度的酶反应底物溶液，单次实验即可快速测定酶反应动力学米氏常数和催

图6 集成微泵微阀的芯片FIA系统

图7 集成微泵微阀的芯片FIA系统的装样和注样

采用芯片上集成微泵微阀进行流动注射分析的方法具有集成度高，可提高系统的微型化和集成化水平，但是芯片的结构和操作皆较复杂，而且需要配置高精度和程序化的电路与气路系统.

1.5 基于取样探针的芯片流动注射分析系统

Du等[20]提出了一种基于毛细管取样探针和缺口型试样管的重力驱动流动注射分析系统，毛细管与芯片耦合作为取样探针，在试样管和载液管上加工可供取样探针进出的缺口，试样管和载液管间隔排列在程序控制的自动平移台上．如图8[20]所示，进行流动注射分析操作时，探针保持水平位置不动，通过一维平移自动平移台上的缺口管阵列，使探针依次经缺口进入样品管和载液管实现样品和载液的切换．该系统流动注射分析操作分三步进行，首先将取样探针停留在载液管内使载流在重力作用下流入芯片通道．第二步，平移自动平移台使取样探针进入样品管内并停留一段时间，一定体积的样品在重力作用下流入芯片通道．第三步，移动平移台使取样探针进入载液管引入载液完成一次流动注射操作.该系统的分析通量最高可达1 000样/h，最低试样消耗仅为0.6 nL/样，分析精度达到0.6%(n=11)．2010年，Sun等[21]建立了一种基于一体化取样探针和缺口管阵列的流动注射液滴分析系统，将样品引入、试剂加入与液滴生成等多单元集成于一体化取样探针内（见图9）[21]．该系统的集成度和自动化程度均较高，为液滴微流控系统提供了一种进行流动注射操作的模式．该系统成功应用于蛋白质结晶沉淀剂的筛选与酶抑制分析．

图8 基于毛细管取样探针的FIA系统

图9 基于一体化取样探针的FIA液滴分析系统

1.6 液滴注射

近年来，液滴微流控受到了包括化学、生命科学与医学等领域科学家的广泛关注，流动注射模式对液滴的取样操作具有借鉴意义．2008年，Fidalgo等[22]提出了采用电融合的方法将流动的水相液滴注入连续的水相流体的方法．当注射区域的电极之间没有施加电压时，液滴流与连续流互不干扰，电极之间施加一定电压时，注射区域的液滴与连续水相流体融合完成液滴的注射．进行液滴注射的另一种方法是将微通道进行选择性修饰．Edgar等[23]和Roman等[24]将液滴生成与流动通道修饰为疏水性质，而电泳分离通道保持亲水性．样品在疏水通道内被油相间隔成液滴，随后注射进入亲水性的分离通道进行电泳分离，实现了液滴生成-液滴流动注射-电泳分离的一体化．Zhu等[25]则开发了一种“亲水舌”的液滴取样结构，将水相液滴从油相注射进入质谱载流中，调节废液池液面高度可改变液滴的进样体积.

2 结论

早在μTAS概念提出之前，流动注射分析的创始人Ruzicka与Hansen就开始致力于流动注射分析的微型化．1984年，Ruzicka与Hansen以FIA的思想为指导提出了集成化微管道系统（integrated microconduit systems，IMCS）的概念[26]，限于当时科学技术的发展水平，这一概念在当时并未能受到足够的重视.随着科学技术水平的持续进步和微加工技术的发展，流动注射分析面临着又一次发展机遇，同时流动注射分析法对微流控芯片分析的微流体操作具有较大的借鉴意义.

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Microfluidic Chip-based Flow Injection Analysis

XU Chun-xiu

（Department of Chemistry,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China）

Flow injection analysis(FIA)revolutionized the traditional analytical chemistry which should be performed under physical and chemical equilibrium,FIA have advantages including wide applicability,high efficiency,low consumption,good reproducibility and automation over traditional analytical methods.Recently,the miniaturized total analysis system(or lab on a chip)evolved rapidly,providing opportunities for developing the theories and technologies of FIA.This paper reviews the various methods for performing FIA in microfluidic chips.

microfluidic chip；flow injection analysis；miniaturized total analysis system

O657 < class="emphasis_bold">文献标识码：A

A

1007-6883(2011)03-0050-06

2011-03-14

韩山师范学院青年科学基金资助（基金编号：413611，413615）

徐春秀（1978-），女，江西吉安人，韩山师范学院化学系讲师.

责任编辑 尔 迟 杨培奎