黄山贡菊挥发油的抑菌及抗氧化性能研究

胡晓倩，吴永祥，朱洋洋

（黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041）

黄山贡菊挥发油的抑菌及抗氧化性能研究

胡晓倩，吴永祥，朱洋洋

（黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041）

通过水蒸气蒸馏法，提取黄山贡菊不同部位（根茎、花、叶）的挥发油，以4种细菌（大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、苏云金芽孢杆菌）和2种真菌（酿酒酵母、突变木霉）作为供试菌种，通过体外抑菌实验研究了黄山贡菊挥发油的抑菌性能。实验表明贡菊的挥发油对6种供试菌种均具有一定的抑制作用，特别是对4种细菌的抑制更加明显。从贡菊不同部位提取的挥发油其抑菌性能有较明显的差异，其中从黄山贡菊叶中提取的挥发油的抑菌性能最强。同时对从黄山贡菊叶中提取的挥发油进行了抗氧化性能的实验研究，结果表明黄山贡菊挥发油有很好的抗氧化能力，能够有效地清除羟自由基和脂过氧自由基，且在实验浓度范围内，随着挥发油浓度的升高其清除能力呈上升趋势。

黄山贡菊；挥发油；抑菌；抗氧化；自由基

黄山贡菊 [Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel.cv.Gongju]是安徽黄山所产地道药材之一，[1]俗称“徽菊”，是我国四大名菊药材(亳菊、滁菊、杭菊、贡菊)之一，已载入1985年版《中国药典》，被誉为“菊中之冠”。黄山贡菊40%用于医药配方，60%用于饮料方面。黄山贡菊主要成分有挥发油、黄酮类化合物、菊甙、维生素B1、氨基酸、无机元素等。[2-4]现代药理研究及临床应用证明，贡菊具有疏风散热、养肝明目、清凉解毒,消炎等功效。[5]目前，学者对黄山贡菊的研究基本都集中在对干花花序中的提取物的提取工艺及成分的研究方面，如秦民坚,龚建国等人对黄山贡菊的挥发油成分进行了实验研究；[6]陈国平、王澎对黄山贡菊干花中黄酮提取物进行了羟自由基清除作用的研究。[7]目前还未见对黄山贡菊不同部位（根茎、花、叶），尤其是叶中提取物的提取工艺、提取物成分及其性能的研究。本实验通过水蒸气蒸馏法，提取黄山贡菊不同部位（尤其是叶）的挥发油，并通过体外抑菌实验对黄山贡菊挥发油的抑菌性能进行研究，同时对从黄山贡菊叶中提取的挥发油进行了总还原能力、对羟自由基，脂过氧自由基清除能力的测定，旨为黄山贡菊的综合开发利用、提高黄山贡菊的产品附加值，为新的产品开发思路提供参考数据，为菊农创造更大的经济价值。

1 实验材料、试剂与仪器

1.1 实验材料

1.1.1 黄山贡菊

植株采自黄山贡菊原产地安徽省黄山市歙县，由黄山学院生命与环境科学学院张慧冲副教授鉴定。

1.1.2 供试菌种

供试菌种由黄山学院生命与环境科学学院微生物实验室提供。

革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli）；变形杆菌（proteusbacillus vulgaris）；

革兰氏阳性菌：枯草杆菌（Bacillus subtil）；苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；

真菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；突变木霉（Trichoderma Vride G）。

1.2 实验试剂

1.2.1 培养基制备[8]

细菌培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml、pH7.2；真菌培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、琼脂20g、水1000ml、pH自然。

1.2.2 抗氧化性实验试剂

磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁，双氧水，邻二氮菲，硫酸亚铁，乙醇，亚油酸，硫代巴妥酸等，以上药品均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.3 实验仪器

BCD-171D容声电冰箱(广东科龙电器股份有限公司)，YP3001N电子天平 (上海精密科学仪器有限公司)，DGX-9073B-2电热鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)，M50高压蒸汽灭菌锅 (上海三申医疗器械有限公司)，ZHJH-C1109B无菌操作台(上海智城分析仪器制造有限公司)，PGX-250B智能光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)，旋转打孔器 (上海奉贤轻工机械一厂)，UV754紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），挥发油提取测定仪 （安徽省天长市千玻教学仪器有限公司）,各种实验用玻璃仪器等。

2 实验方法

2.1 黄山贡菊不同部位挥发油的提取[9]

称取贡菊花200.0g，剪碎呈粒径约4mm，以1∶3料液比加蒸馏水浸泡12h，在挥发油提取器蒸馏4h,结束后经油水分离得挥发油，而剩下少量的油和水作为挥发油与水的混合物。并分别制根、茎、叶的挥发油以及挥发油与水混合物，然后置于4℃冰箱分别保存，备用。

2.2 菌悬液的制备

预先将供试菌种接种到试管培养基斜面进行活化，细菌于37℃恒温培养箱中培养24h，真菌于28℃恒温培养箱中培养72h。无菌操作台内用接种环挑取已活化好的菌种接种到无菌生理盐水中，用球计数板计数，配成菌体105-106个/ml菌悬液。

2.3 抑菌实验——滤纸片法[10]

在无菌操作台中将熔化并灭菌的固体培养基倒入已灭菌的培养皿，冷却凝固后，加入菌悬液涂布均匀做成含菌平板；将培养皿背面划线平分3份，分别记为1、2、3号区，然后用灭菌过的镊子在每号区中央放入滤纸片：其中1号区滤纸片沾无菌蒸馏水作为对照；2号区滤纸片沾挥发油与水的混合物；3号区沾纯的挥发油，每种样液每种测试菌平行3份。然后将细菌在37℃培养箱中培养24h,真菌在28℃培养箱中培养72h,测量抑菌圈的直径大小,取其平均值。

2.4 黄山贡菊挥发油抗氧化能力（普鲁士蓝法）[11，12]

将叶中提取的挥发油按照体积比分别稀释成0.1%、0.2%、0.01%、0.02%，各取1ml，加pH6.6磷酸钠缓冲液 2.5ml，加 1%铁氰化钾 2.5ml，50℃水浴20min，加10%三氯乙酸2.5ml，取上述混合液2.5ml，分别加2.5ml1%双氧水和0.1%三氯化铁2.5ml，静置10min，在700nm处测吸光值。吸光值越大，说明还原性越强，抗氧化性越强。

2.5 黄山贡菊挥发油清除羟基自由基的测定[13]

取5mmol/L邻二氮菲1.5ml，加4.0ml磷酸钠缓冲液 (pH7.4)混匀，再加7.5mmol/L硫酸亚铁1.0ml，加叶中挥发油提取液 （浓度分别为1.0%、2.0%、10%、20%）1.0ml，加1.5ml蒸馏水，加1%双氧水1.0ml，37℃水浴加热1h，于536nm处测定吸光值。

羟基自由基清除率的公式如下：

OH清除率（%）=A（加）-A(损)/A(未损)-A(空白)⋆100%

式中A(加)：加入样品（抗氧化剂）及双氧水；A (损)：不加入抗氧化剂只加双氧水：A(未损)：两者都不加；A(空白)：加蒸馏水。

2.6 黄山贡菊挥发油清除脂过氧自由基的测定[13]

将 5.0ml乙醇，5.0ml磷酸纳缓冲液（pH8.0、0.1mol/L），0.5ml亚油酸，0.5ml叶中挥发油提取液（浓度分别为1.0%、2.0%、10%、20%）混合，用无菌操作台的紫外光照射2h，再加4.0ml三氯乙酸，加1.0ml硫代巴比妥酸，放置在95℃水浴1.5h，离心，去油层，在532nm处测吸光值。以蒸馏水代替试样做空白对照。脂过氧自由基清除率公式：脂过氧自由基清除率=[A0-A]/A0，式中A0为空白溶液吸光度；A是待测试样测得的吸光度。

3 实验结果与分析

3.1 挥发油的抑菌效果的比较研究

纯挥发油、挥发油与水混合物这两种不同抑菌因素(蒸馏水作为对照)对供试菌种的抑菌实验结果如图1，抑菌圈的直径（单位mm），其中数据为平行3次实验后的平均值。

由图1可知，纯挥发油、挥发油与水混合物对6种供试菌种均有一定的抑制作用，且纯挥发油的抑菌效果明显强于挥发油与水混合物的抑菌效果。不同菌种对纯挥发油、挥发油与水混合物的敏感性有差异，4种细菌总体比2种真菌敏感性高，细菌中的大肠杆菌对挥发油的敏感性最高。

3.2 黄山贡菊挥发油抑菌效果的比较研究

贡菊的花、叶以及根茎中提取的挥发油对6种供试菌种的抑菌实验结果如图2，抑菌圈的直径（单位mm），其中数据为平行3次实验后的平均值。

由图2可知：从贡菊不同部位提取的纯挥发油对6种供试菌种均有一定的抑制作用，但以从叶中提取的挥发油的抑菌效果最强，其次为从花中提取的挥发油，最后为从根茎中提取的挥发油。不同菌种对纯挥发油的敏感性有差异，4种细菌总体比2种真菌敏感性高，而尤以细菌中的大肠杆菌对叶挥发油的敏感性最高。

3.3 黄山贡菊叶中挥发油抑菌效果的比较研究

用叶中提取的挥发油（0.0025ml/g）对6种供试菌种不同菌液浓度进行了抑菌因素敏感性的比较，将加入培养皿的6种菌液分别设为0.1ml、0.2ml、0.3ml 3个梯度进行了抑菌效果的对比，结果如图3，抑菌圈的直径（单位mm），其中数据为平行3次实验后的平均值。

由图3可知，当抑菌因素相同时，随着6种供试菌种菌液溶度的升高，黄山贡菊叶中挥发油对其的抑菌效果逐渐减弱。

3.4 黄山贡菊叶中挥发油的总抗氧化能力的测定

采用不同浓度的黄山贡菊叶中提取的挥发油，按照2.4（普鲁士蓝法）进行抗氧化能力的测定，结果如图4。

由图4可知，黄山贡菊叶中提取的挥发油有较强的抗氧化能力，并且抗氧化能力随着挥发油浓度的增大而提高。黄山贡菊叶中挥发油可以作为食品、化妆品、药品等中的天然抗氧化剂使用。

3.5 黄山贡菊叶中挥发油清除羟基自由基能力

按照2.5的实验方法，将叶提取的挥发油设置4个不同的浓度（1%、2%、10%，20%），进行清除羟基自由基能力的测定，结果如表1。

表1 黄山贡菊叶中提取的挥发油对羟基自由基的清除能力

由表1,图5可知，黄山贡菊叶中提取的挥发油对羟基自由基有显著的清除作用，并且随挥发油浓度的增大，清除率随之增加。

对于生物体而言，羟自由基是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基，它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，且反应速度快。羟自由基的半衰期很短，一般存在时间不足，即它与其他分子反应而全部消失。然而，由它引起的自由基链反应却可在较大范围内造成生物体的损害。[12]此实验表明，黄山贡菊叶中的挥发油提取物可通过良好的清除羟基自由基能力来保护机体的健康,此研究为黄山贡菊作为保健饮料、医药临床的深层次开发提供了参考数据。

3.6 黄山贡菊叶中挥发油清除脂过氧自由基能力

按照2.6的实验方法，将叶提取的挥发油设置4个不同的浓度（1%、2%、10%，20%），进行清除脂过氧自由基能力的测定，结果如表2和图6。

表2 贡菊叶中提取挥发油对脂过氧自由基的清除率

由表2,图6可知，黄山贡菊叶中提取的挥发油对脂过氧自由基有显著的清除作用，在实验浓度范围内，随其浓度的升高清除率呈上升趋势。

乙醇在碱性有氧、强紫外线照射下光解产生CH3（OH）CH·并作为自由基引发剂直接作用于亚油酸产生R·，然后氧化形成脂过氧自由基（ROO·），再分解为丙二醛(MDA）。[14]不饱和脂肪酸这种链锁反应很难自动终止，除非加入氧自由基捕捉剂（AH）方可终止反应。实验数据显示，黄山贡菊叶中的总黄酮提取物对脂自由基有较好的清除能力，可以作为天然抗氧化剂——氧自由基捕捉剂来抑制不饱和脂肪酸的过氧化。

4 问题与讨论

有学者[15]进行了菊花花序中提取的挥发油对细菌与真菌的抑菌试验，培养结果出现相应的抑菌圈，说明挥发油对细菌与真菌的生长有不同程度的抑制作用。但却未见报道贡菊叶、花及根茎提取的挥发油抑菌效果的比较，而本实验的研究数据表明，叶中提取的挥发油，不仅是同等条件下与从花、根茎中提取的挥发油的量最多，而且抑菌效果更是最好的。以后在贡菊的综合开发利用中，不仅要注重花的开发利用，叶以及根茎的开发价值也是不可忽略的。

随着对贡菊挥发油研究的不断深入，表明挥发油具有疏风、清热、明目、解毒的功效。[16，17]现代药理也表明，菊花中的挥发油具有抗炎、镇痛、抗病毒、抗菌、抗衰老、抗肿瘤、抗诱变等方面作用。目前，国内外已经逐步地把菊花的挥发油作为生物活性物质广泛应用到生物制药、保健食品等领域。本实验研究显示，贡菊叶中提取的挥发油量较高，而且抑菌效果比花、根茎提取的挥发油更显著。从黄山贡菊叶中提取的挥发油有较好的抗氧化能力，能有效清除羟自由基，脂过氧自由基。因此，系统地开展挥发油的抑菌及抗氧化性能的应用研究有待深入进行，可以突破饮品方面的应用，扩大应用领域，如可以作为天然抗氧化添加剂应用到食品、医药、化妆品、保健品等领域，这可为黄山贡菊的综合开发利用，提高产品附加值提供新的发展思路。

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Study on the Bacteriostatic and Anti-oxidative
Properties of Volatile Oil from Yellow Mountain Chrysanthemum Tea

Hu Xiaoqian，Wu Yongxiang，Zhu Yangyang
(School of Life and Environment Sciences,Huangshan University,Huangshan245041,China)

Volatile oil is extracted from different parts (roots and stems,flowers,leaves)of yellow mountain chrysanthemum tea by steam distillation (SD).The bacteriostatic property of its volatile oil is studied with four kinds of bacteria (Escherichia coli,Proteusbacillus vulgaris,Bacillus subtil and Bacillus thuringiensis)and two kinds of fungi (Saccharomyces cerevisiae and Trichoderma Vride G)as test subjects through extraneous bacteriostatic tests.The results show that its volatile oil has bacteriostatic action on all the six strains,and the action on the four kinds of bacteria is more evident than that on the two kinds of fungi.Besides,there is a remarkable difference in the bacteriostatic property of volatile oil from different parts of yellow mountain chrysanthemum tea.Volatile oil extracted from its leaves has the strongest bacteriostatic activity.Meanwhile,the anti-oxidantion capacity of volatile oil extracted from the leaves of yellow mountain chrysanthemum tea is studied.The results show that volatile oil extracted from its leaves has a good anti-oxidant capacity,and can effectively scavenge hydroxyl radicals and lipid peroxy radicals.In the experimental concentration range,its scavenging capacity rises with the increase of the concentration of volatile oil.

yellow mountain chrysanthemum tea;volatile oil;bacteriostasis;anti-oxidantion;free radical

Q946.91

A

1672-447X(2011)05-0063-05

2011-03-20

黄山学院自然科学研究项目（2010xkj004）；黄山学院大学生科研项目（2008xdkj043）

胡晓倩(1972-)，安徽绩溪人，黄山学院生命与环境科学学院副教授，研究方向为生物化学和微生物生理。

胡德明