益母草水提物对小鼠前体脂肪细胞体外增殖能力的影响

屈长青 许艳华 代向向

益母草水提物对小鼠前体脂肪细胞体外增殖能力的影响

屈长青1，2＊许艳华1代向向1

（1阜阳师范学院生命科学学院；2抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽阜阳236041）

目的 探讨益母草水提物对小鼠前体脂肪细胞的增殖的影响，旨在了解益母草新的药用价值。方法 分离培养小鼠前体脂肪细胞，取传代细胞，用不同浓度的益母草水提物处理，MTT法检测前体脂肪细胞增殖情况。结果 益母草水提物可明显抑制小鼠前体脂肪细胞的体外增殖，并呈一定的剂量依赖性，其机制有待进一步研究。

益母草水提物；小鼠；前体脂肪细胞；增殖

近年来，随着肥胖人群的日益增多，由此引发的各种疾病的发病率也日益攀升，给人们的健康造成了严重的威胁。经研究，体内脂肪细胞的数目过多或体积过大都会导致甘油三酯等的过多积累，进而在一定程度上引起脂肪层的过度增厚［1］。唇形科植物益母草（Leonurus Japonicus Houtt）味苦、微寒，有活血、降脂、消炎镇痛等功效，自古以来就享有“血家圣药”的美称［2］。益母草提取实验表明其化学成分主要是黄酮类、有机酸、生物碱类等，此外还含有对人体有益的多种微量元素，其中研究较多的是生物碱类［3］。随着现代对中草药研究方法的不断创新和改进，益母草在其他诸方面的药用价值也不断被发现［4］，但其对于减肥作用的研究和应用尚不多，为此，现就益母草水提物对于小鼠前体脂肪细胞体外增殖的抑制作用进行探索，以期为益母草在控制肥胖方面的应用提供参考。

材料和方法

1.材料

清洁级四周龄雄性小鼠6只，由胚胎发育与生殖调节安徽省省级重点实验室提供。

2.主要试剂

Ⅰ型胶原酶消化液；PBS缓冲液；胰酶消化液 ；MTT溶液；无血清 M199培养液；10%血清 M199培养液。

3.方法

3.1 小鼠前体脂肪细胞的原代培养［5，6］

小鼠断颈处死，置于75%酒精中浸泡3-5min，无菌缓冲间内用灭过菌的解剖器械剪开小鼠皮肤，小心分离小鼠腹股沟处的带状脂肪组织，PBS冲洗3次，用眼科剪将其剪成1mm3左右的小块，按照细胞：酶液＝1∶2的体积比加入Ⅰ型胶原酶消化液，37℃恒温箱中消化60min（每5min振荡一次），加入等量的10%血清M199培养液终止消化，细胞筛过滤以除去未被消化的脂肪组织碎片，2000r／min离心5min，弃上清液，加入适量的无血清M199培养液2000r／min离心5min，弃上清液，再加入适量的10%血清M199培养液吹打混匀成细胞悬液，接种至30mm细胞培养皿，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，1d后换液，以后每2d换液一次。

3.2 不同浓度益母草水提物培养液的配制

称取1g益母草加入200ml双蒸水中浸泡过夜，超声波提取两次，每次40min，双层滤纸过滤后浓缩备用。浓缩液经微孔滤膜过滤后用10%血清M199培养液分别配成1.0mg／mL、1.5mg／ml、2.0mg／ml、2.5mg／m、3.0mg／ml五种浓度的溶液各5ml，分别标记为AEMH1-5，装于青霉素小瓶中，置4℃冰箱保存备用。

3.3 小鼠前体脂肪细胞的传代培养及鉴定

细胞培养5d左右即可长成覆盖率为70%-80%的细胞单层，此时取出长满细胞的30mm培养皿，吸弃原培养液，PBS冲洗3次，加入1ml经预温处理的胰酶消化液，置于倒置显微镜下观察，待贴壁细胞皱缩变圆时加入1ml 10%血清M199培养液终止消化，轻轻吹打皿内溶液使贴壁细胞悬浮，将细胞悬液转移至离心管内，2000r／min离心5min，弃上清液，加适量的10%血清M199培养液吹打混匀成细胞悬液，用细胞计数板对细胞进行计数，以1×105个细胞接种于96孔细胞培养板（每孔总培养液为100μL），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

小鼠前体脂肪细胞的鉴定参照屈长青等文章［5，6］，台盼蓝拒染法检测细胞存活率，然后以1×105个／ml的密度将细胞接种于事先铺有盖玻片的60mm培养皿中，置于培养箱（37℃，饱和湿度，5%CO2）培养，24h后换液，以除去未贴壁的细胞，之后每2-3天 换1次液。培养8d后取出细胞爬片，进行油红0染色鉴定。

3.4 MTT法检测前体脂肪细胞增殖情况

细胞在96孔培养板中接种培养1d后，单层覆盖率可达50%左右，吸弃原培养液，PBS冲洗2次，各孔分别加入不同浓度的益母草水提物配制的培养液100μl，其中每种浓度均加3个孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。2d后，每孔分别加入15μl MTT溶液，置于细胞培养箱中继续培养4h，吸弃孔内溶液，使培养进程终止，每孔再分别加入150μlDMSO溶液，将96孔板置于微孔振荡器上振荡10min使结晶物充分溶解，用全自动酶标仪在波长490nm处测定各孔光吸收值，记录结果。每个浓度均设3个复孔，实验重复3次，求取各组平均值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（对照组OD值-给药组OD值）／对照组OD值×100%［4］，其中不加益母草水提物的培养液所在的孔为对照组，其他各孔为给药组。

4.统计学处理

实验所得数据以平均数±标准差（¯x±s）表示，应用SPSS 13.0统计软件对数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差分析采用 LSD法，组间比较P＜0.05表示差异显著。

结 果

MTT法是一种被普遍采用的间接反应活细胞数量的方法，MTT比色结果见下表。

表1 MTT比色结果（¯x±s）Table 1 Result of MTT（¯x±s）

从上表可以看出：随着益母草水提物浓度的逐渐增大，OD值呈明显下降趋势，即活细胞数目越来越少。

图1 不同浓度益母草水提物对小鼠前体脂肪细胞的增殖抑制率Fig.1 Inhibition rates of different AMEH concentration on mice preadipocytes

从上图抑制曲线可以看出：益母草水提物对前体脂肪细胞的增殖有明显抑制作用，并且抑制率的大小取决于益母草的浓度。0mg／ml到1.5mg／ml浓度范围内，前体脂肪细胞的增殖明显受到抑制；浓度在2.0mg／ml到2.5mg／ml范围内的益母草水提物对前体脂肪细胞的抑制效果维持一定水平，当浓度增大到3.0mg／ml时，抑制曲线又呈现出明显上升的趋势。

讨 论

一直以来，益母草主要是作为妇科药被人们熟知，对于一些常见妇科病如原发性痛经、乳腺增生症等都有着很显著的治疗效果。除此之外，益母草在溶解血栓、降低血液黏度、降低血脂等诸多方面的药用价值也逐渐被发现。随着研究的不断深入，益母草的药用价值越来越显著，然而有关益母草能否抑制脂肪细胞增殖方面的研究仍比较少。本实验发现益母草水提物对前体脂肪细胞的增殖有明显抑制作用，并且呈现浓度依赖性，随浓度升高，在1.5mg／ml至2.5mg／ml时，会维持一定的水平，但具体哪种物质通过何种机制抑制脂肪细胞增殖还无从得知，而当浓度增大到2.5mg／ml以上浓度时，益母草水提物对细胞产生一定的毒害作用，从而达到抑制细胞增殖的目的，这些问题都有待于进一步的研究和论证。

［1］刘学哲.肥胖的研究现状与展望.体育科技文献通报，2009，17（2）：113-114

［2］顾月丽，顾江红.益母草药理作用的研究进展.中国中医院科技，2008，15（4）：320-321

［3］严优芍.益母草不同提取方法的比较研究.中医院导报，2010，16（5）：109-110

［4］宋霏.益母草提取物抗癌研究.实用中西医结合临床，2010，10（4）：82-83

［5］屈长青，李东伟，朱茂英.一种改进的培养脂肪细胞染色法.中国组织化学与细胞化学杂志，2008，13（3）：329-330

［6］屈长青，张国华，陈粉粉，等.猪前体脂肪细胞的原代培养.农业生物技术学报，2005，13（5）：649-653

Effect of aqueous extract of motherwort herb on proliferation of mice preadipocytes in vitro

Qu Changqing1，2＊，Xu Yanhua1，Dai Xiangxiang1
（1Fuyang Normal College of Life Sciences，AnHui，China；2Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine，Fuyang236041，China）

Objective To explore the influence of different concentrations of the aqueous extract from Motherwort Herb（AEMH）on the proliferation of mouse preadipocytes in vitro.Methods After treating the cells with AEMH at various concentrations（1.0-3.0mg／mL）for 24h，the proliferation rate of mouse preadipocytes was detected with MTT method.Results AEMH inhibited the proliferation of preadipocytes in a dose-dependent manner.Conclusion AEMH can significantly inhibites the proliferation of mouse preadipocytes in vitro.

AEMH；Mouse；Preadipocyte；Proliferation inhibition

R349.5

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.016

2011-06-14

2011-10-23

国家自然科学基金资助（31172182）；安徽省教育厅自然科学研究资助项目（KJ2011B127）

屈长青，男（1972年），汉族，副教授。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）