CP慢性染毒对大鼠脑皮层乙酰胆碱酯酶活性的影响

姚茂忠，陈湛娟，杨照新，李林芳

（1.海南医学院海南省药物安全性评价研究中心，海南 海口571101；2.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口571158；3.先声药业有限公司，海南 海口570216）

CP慢性染毒对大鼠脑皮层乙酰胆碱酯酶活性的影响

姚茂忠1，陈湛娟2，杨照新1，李林芳3*

（1.海南医学院海南省药物安全性评价研究中心，海南 海口571101；2.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口571158；3.先声药业有限公司，海南 海口570216）

为探讨CP慢性染毒对大鼠脑皮层乙酰胆碱酯酶活性的影响，将120只雄性大鼠随机分为4组，即对照组（花生油）、低剂量组（40 mg/kg CP）、中剂量组（80 mg/kg CP）和高剂量组（160 mg/kg CP），每组30只.灌胃给药28次，每日1次，共28d，每日观察动物症状.给药14d、28d和给药结束后7d各组分别选择10只动物，处死动物分离脑皮层，免疫组化测定AChE活性.结果显示：CP慢性染毒后大鼠表现出神经受损症状，低、中和高剂量组皮层AChE活性均显著降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性.结果表明：神经损伤大鼠脑皮层AChE活性显著降低，AChE活性具备成为神经损伤标志物的潜力.

CP；脑皮层；乙酰胆碱酯酶

氯氰菊酯（cypermethrin，CP）是拟除虫菊酯类杀虫剂，其对哺乳动物神经的损伤作用已得到证实[1].乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是生物神经传导中的一种关键性的酶，在神经受损后，其活性发生异常变化.本试验拟用CP作为工具药致大鼠脑神经损伤，探讨CP慢性染毒对脑皮层AChE活性的影响，以期发现神经毒性的标志物.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试物

氯氰菊酯（CP），含量≥95%，由北京市农科院提供.

1.1.2 动物

SPF级SD雄性大鼠120只，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供（合格证号HNNS⁃DC2010089），体重80～100 g，普通颗粒饲料喂养，自由饮水，自由采食.

1.1.3 试剂

Rabbit anti-AChE 、Capri-anti Rabbit、SABC免疫组化试剂盒和DAB染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及处理

大鼠按体重随机分为4组，分别为阴性对照组（灌胃给予花生油）、低剂量组（按40 mg/kg给予CP）、中剂量组（按80 mg/kg给予CP）和高剂量组（按160 mg/kg给予CP），灌胃给药，给药体积为每100克体重1 mL.每日给药1次，共28次.每日给药前进行行为学和采食量观察.给药后14、28d和给药结束后7d各组分别处死大鼠10只，分离脑皮层，测定AChE阳性表达.

1.2.2 指标测定

脑皮层AChE阳性表达测定，采用免疫组织化学法[2].将分离的皮层用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规脱蜡至水，3%H2O2室温25℃灭活内源性酶，微波炉加热修复，5%BSA室温封闭20 min，加一抗Rabbit anti-AEHE 4℃过夜，滴加Ca⁃pri-anti Rabbit IgG，37℃孵育20 min，滴加试剂SABC，37℃孵育20 min，各步骤用PBS漂洗3次，DAB染色，苏木精淡染胞核，常规脱水，透明、封片.用Image Pro Plus 5.0图像分析系统对AChE阳性细胞的积分光密度进行测定，每张切片3个视野.

1.3 统计方法

采用SPSS11.5软件进行分析.结果用均数±标准差（-x ±s）表示.

2 结果

2.1 动物行为学观察结果和采食状况

低、中和高剂量组大鼠出现不同程度的食欲减退、行为迟缓、反应迟钝和精神抑制等神经毒性症状.

2.2 脑皮层AChE活性

皮层AChE活性见表1.给药14d高剂量组AChE活性显著低于对照组（P＜0.05）；给药28d和试验结束时，3个剂量组AChE活性均显著低于对照组（P＜0.05），并呈剂量依赖性.停药后7d（实验结束），3个给药剂量组AChE活性稍有升高，但无明显恢复.表明CP对脑皮层AChE活性具明显抑制作用.

表1 大鼠脑皮层乙酰胆碱酯酶活性Tab.1 The AChE activity of cerebral corten in rats

3 讨论

AChE是生物神经传导中的一种关键性的酶，其在胆碱能突触间降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递[3].

CP是含α-氰基的拟除虫菊酯杀虫剂.其因高效、低毒等优点在农业生产中得到广泛应用.CP能够在大鼠血液、肾、心肺、肝和脑等组织中分布，其浓度分布顺序依次为：肾＞心＞肺=肝＞脑[4].CP不仅能够降低全血AChE活性[5]，且有明确证据表明CP对大鼠大脑具有损伤作用：干扰大鼠脑组织Glu-Gln环路代谢[6]，导致脑缺血样变形和神经元胞浆核固缩[7].CP可能对脑组织各区域均有影响，目前发现脑海马受到CP的影响：CP可降低大鼠海马谷氨酰胺合成酶活性[8]，诱导大鼠海马nNOS基因表达增强[9]；而CP对于脑皮层AChE活性的影响，尚未见报道.

本研究发现，大鼠连续28 d给药，表现出反应迟钝、行为迟缓等神经毒性症状，表明CP对脑具有损伤作用；在给药第14d，给药各剂量组脑皮层AChE活性下降，高剂量组达到显著水平（P＜0.05）；给药第28d，各给药剂量组AChE活性显著下降（P＜0.05）；恢复7d后，各给药剂量组AChE活性下降仍然显著低于阴性对照组（P＜0.05），但与给药28d相比，活性虽稍有上升，但与正常水平仍然相差甚远.表明在短期内，CP对脑皮层AChE活性的影响不能得到恢复.脑皮层AChE活性受抑制程度随给药剂量增加而增大，表现出剂量依赖性.

CP对于大鼠脑皮层AChE活性的降低影响，结合大鼠行为学表现的神经毒性症状，表明AChE活性可能是神经毒性的标志物之一，其具备应用于饲料、兽药和药品安全性评价研究的潜力.至于CP降低脑皮层AChE活性的机制，尚需后续研究.

[1]贺锡雯,吕京.有机磷类和拟除虫菊酯类的神经毒作用机理[J].中国药理学与毒理学杂志,1997,11(2):89-90.

[2]牛英才,董妙先,兴桂华,等.Aβ1-40脑内注射对大鼠海马AchE和NOS1表达的影响及加减地黄饮子的干预作用[J].中药药理与临床,2007,23（5）:149-151.

[3]唐希灿.基础神经药理学[M].北京:科学出版社,1999.

[4]宋亚娟,丁国华,刘扬,等.氯氰菊酯的检测方法及其在大鼠体内毒代动力学研究[J].工业卫生与职业病,2010,36（1）:7-10.

[5]李海斌,李君,姚三巧.氯氰菊酯对雌性大鼠内分泌干扰和全血乙酰胆碱酯酶的影响[J].中国职业医学,2007,34(4):292-295.

[6]孙静.乙体氯氰菊醋对大鼠脑组织谷氨酸-谷氨酞胺环路的干扰及其机制探讨[D].沈阳:中国医科大学,2010.

[7]Ferah S,Nefise ü,Yigit U,et al.Neurotoxic effects of cy⁃permethrin in wistar rats:a haematological,biochemical and histopathological study[J].Journal of Health Science,2005,51(3):300-307.

[8]安丽,赵越,杨军,等.乙体氯氰菊酯对雄性大鼠海马谷氨酰胺合成酶活力的影响[J].毒理学杂志,2006,20（2）:105-106.

[9]吴建平,夏若寒,石年,等.氯氰菊酯诱导大鼠中枢一氧化氮合酶表达增强[J].南京医科大学学报,1999,19（5）:357-359.

Effect of Chronic Exposure to CP on AChE Activity of Cerebral Cortex in Rats

YAO Maozhong1，CHEN Zhanjuan2，YANG Zhaoxin1，LI Linfang3＊
（1.Research Center for Drug Safety Evaluation of Hainan Province，Hainan Medical College，Haikou571101，China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University，Haikou571158，China；3.Simcere Pharmaceutical Co.L.T.D.，Haikou570216，China）

To study the effect of chronic exposure to CP on AChE activity of Cerebral Cortex in Rats,120 male SD rats were equally divided into 4 groups,including control group(peanut oil),low dosage group（40 mg cp/kg body）,middle dosage group（80 mg cp/kg body）and high dosage group（160 mg cp/kg body）.Intragastric administration at 1 time a day were planed,the treatment lasted 28 days.General symptoms of rat were observed everyday.10 rats of each group were selected at 14,28 day after treatment and 7 days after last treatment,respectively,cerebral cortex of selected rats were separated,AChE activity were measured by immunohistochemistry.Results showed that rats displayed symptoms of nerve damage,AChE activity of cerebral cortex of 3 administration were all decreased significantly（P＜0.05）,dose-de⁃pendent was found.Results indicated AChE activity of cerebral cortex were decreased significantly in nerve damage rats,AChE activity may be treated as marker of nerve damage.

Cypermethrin；Cerebral Cortex；Acetylcholinesterase

Q 556+.1

A

1674-4942（2011）02-0192-02

2011-03-30

海南省自然科学基金项目（808163）

*通讯作者

毕和平