YC-1抗肝癌作用机制的研究进展

罗子俨（综述），蒋敬庭，秦锡虎（审校）

（1.苏州大学附属第三医院肝胆外科，江苏常州 213003;2.苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，江苏常州 213003;3.常州市中医院，江苏常州 213003）

3-（5'-羟甲基-2'-呋喃基）-1-苯甲基吲唑［3-（5'-hydroxymethyl-2'-furyl）-1-benzyl indazole，YC-1］是一种人工合成的化合物，Ko等［1］首次发现其可抑制分离的血小板聚集、三磷酸腺苷释放，并能提高细胞内游离钙浓度，这一作用是由鸟苷酸环化酶的激活、环磷酸鸟苷和环磷酸腺苷的升高引起的。随着对YC-1的深入研究还发现其对防止血管内血栓形成、激活血管平滑肌可溶性鸟苷酸环化酶而舒张动脉等具有重要的意义［2］。Teng等［3］发现，YC-1 在血小板丰富时有抗血栓形成的作用。Yu等［4］发现，YC-1在体外抗小鼠血管平滑肌细胞增殖;也有研究报道其对主动脉平滑肌松弛有调节作用［5］。YC-1 在抗肿瘤方面的作用主要包括抑制低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）［6］、细胞周期 阻 滞［7］、诱 导 细 胞 凋亡［8］、抗血管生成［9］和抗炎性反应［10］等。针对抗肝癌的作用机制，YC-1主要通过抑制HIF-1和血管内皮细胞因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）的表达来抑制肝癌的转移与复发。因此，抗肝癌的作用机制已成为近年来肝癌免疫治疗的研究热点。

1 YC-1抑制HIF-1和VEGF的抗肿瘤作用

缺氧是实质性肿瘤物理微环境的基本特征之一。许多实体肿瘤具有缺氧的微环境，肿瘤细胞对缺氧的自身调节和适应机制主要是通过提高葡萄糖转运、糖酵解及形成血管体系。肿瘤的缺氧不仅是发生恶性转化的始动因素，还可以诱导肿瘤细胞对放疗及化疗的耐受性，促进肿瘤的浸润和转移等恶性生物学行为的发生［11］。

HIF-1位于染色体14q21～24，作为一转录因子作用于低氧诱导基因，表达于多种人类恶性肿瘤中，在肿瘤的发展中扮演着重要角色。HIF-1是目前所发现的介导细胞缺氧反应最关键的核转录因子，由HIF-1α和HIF-1β两种亚基聚合而成，活性由HIF-1α决定。它涉及缺氧时的能量代谢、血管生成、细胞存活、侵袭和抗药性。因此，抑制HIF-1的表达成为人类抗癌治疗的新平台［12］。

VEGF是一种作用强大的促血管生长因子，在肝癌的发生转移过程中占中心地位，作为与原发性肝癌转移和预后有关的重要因子，已经得到深入的研究。在正常肝脏组织中，VEGF的表达很低，但在原发性肝癌肝外转移灶中有明显升高的表达［13］，有助于肝癌的溶骨性转移［14］。VEGF与趋化因子受体CXC家族趋化因子受体4、细胞角蛋白CK-19被证实为肝癌淋巴结转移的独立危险因素。大量研究已经表明，VEGF不仅可独立影响和衡量肝癌预后，而且可与多种细胞因子共同作用来促进肝癌的转移与复发［15］。VEGF已经成为肝癌治疗靶向药物首选作用的细胞因子，如贝伐单抗［16］、黄连素［17］等。HIF-1 位于VEGF启动子中，任何一种抑制HIF-1的药物都可影响VEGF的表达。

YC-1的作用不依赖一氧化氮，但其作用类似于一氧化氮的某些生物学反应。在缺氧细胞中YC-1阻断促红细胞生成素和VEGF mRNΑ的表达，并且抑制HIF-1的DNA结合，同时也减少因钴和脱铁氨诱导的HIF-1聚集。研究发现［18］，YC-1对HIF-1的作用更多的是抑制HIF-1的激活，而并非减少HIF-1的蛋白水平。它抑制反式激活应答区必须依赖反式激活结构域中缺氧相关酶Asn803，该酶为抑制HIF-1的靶点。

有研究表明在小鼠实验中，YC-1抑制肝癌细胞中HIF-1α的合成和稳定，这一作用机制依赖小鼠双微体 2［19］。Shin 等［20］将肝癌 Hep3B 细胞以聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法测定HIF-1α表达，发现HIF-1α在常氧条件（20%氧浓度）下表达很低，并且HIF-1α siRNA和YC-1同样可以抑制其表达，这说明在常氧条件下，HIF-1α的抑制也可能阻止肿瘤的侵袭和转移。该研究还提示，肝脏转移的媒介是静脉系统，而不是腹膜种植和细胞从脾脏渗漏出来。经YC-1治疗后，鼠的肝脏荧光强度下降99.97%，转移灶也明显下降。该研究通过生化方式检测肝脏转移病灶荧光蛋白水平，发现YC-1治疗后的肝脏荧光蛋白明显下降。这些研究表明，YC-1能在体内有效地抑制肝转移。Xia等［21］发现在低氧条件下（1%氧浓度），HIF-1α和热休克蛋白在HepG2细胞中显著增加，以YC-1或 HIF-1α siRNA作用于 HepG2细胞，HIF-1α和热休克蛋白受到明显抑制。另外，针对VEGF启动子中HIF-1α激活位置的抗基因技术能抑制VEGF的表达和肝癌细胞生长［22］。

恶性肿瘤的侵袭和转移是癌症的重要特点，其中新生血管成为中心环节。VEGF和VEGF受体在血管生成中有重要作用。在肿瘤内部存在低氧环境，HIF-1α有很明显的高表达，同时VEGF水平也增高，新生血管密度增加，促进肿瘤生长。HIF-1α是VEGF主要的上游调控因子，HIF-1α/VEGF信号通路已被证实与促进肝癌形成有关［23］。YC-1抑制HIF-1α，从而负调控VEGF的表达，抑制肝癌血管生成，抑制肝癌的生长、侵袭和转移。

2 YC-1对细胞周期阻滞的作用

在细胞周期中，YC-1能有效抑制细胞生长。它发挥作用主要在细胞周期的 G0～G1期［7］:在 G1期YC-1诱导一种细胞生长抑制素来阻滞细胞周期变化。用50 μmml/L剂量的YC-1作用于肝细胞癌HA22T细胞株时，YC-1不会引起明显的细胞死亡和乳酸脱氢酶的释放。因此，YC-1对细胞的影响不是通过细胞毒性作用而是通过抑制细胞生长实现的。当YC-1的剂量在10～100 μmml/L变化时，细胞周期的抑制也主要出现在G1期，并伴随S和G2～M期变化。同时，YC-1诱导细胞凋亡是一种非环磷酸鸟苷依赖途径。蛋白激酶G抑制剂KT-5823等依赖环磷酸鸟苷蛋白激酶不能阻碍YC-1对细胞周期的抑制作用，而单纯运用YC-1的细胞内环磷酸鸟苷没有过多表达。

细胞周期依赖激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）p21CIP1/WAP1和相关的细胞周期依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2是 YC-1诱导HA22T细胞G1期阻滞的因素。YC-1对HA22T细胞中细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、CDK2或CDK4的表达无明显改变。相反，YC-1能刺激p21CIP1/WAF1的大量增加和p27KIP1的适量增加。YC-1同时作用于 CKI p27KIP1和 CKI p21CIP1/WAF1，它们是CDK细胞周期蛋白的相关蛋白，用免疫沉淀法观察YC-1对CDK-CKI化合物的影响，研究发现YC-1明显提高了 CKI p21CIP1/WAF1和 CDK2的结合而并非CKIp27KIP1，而两者对 CDK4 的结合均没有升高［7］。因此，CKI p21CIP1/WAF1的上调和与其相关的CDK2说明YC-1诱导HA22T细胞G1期阻滞。

Yeo等［24］发现YC-1作用于肝细胞癌Hep3B细胞株24 h后，S期细胞明显增多，比作用前增加33%，而G0～G1期的细胞数量下降32%。此时去除YC-1后，S期细胞减少到与对照组相同的水平。说明YC-1对Hep3B细胞S期的阻滞作用是可逆的，并且与胚胎肾脏细胞HEK293和肾癌细胞Caki-1相比，YC-1的抑制作用虽不及 HEK293敏感，但比Caki-1更敏感。在不同肝癌细胞株中，YC-1对细胞周期的不同阶段有抑制作用，说明其抗癌作用具有普遍性和特异性。

YC-1能在一定程度上诱导肝癌细胞凋亡。Lau等［25］研究表明，YC-1能独立下调磷酸化信号转导蛋白和转录激活物的表达。在体外实验中，当其与顺铂联合时，YC-1能进一步促进肿瘤细胞凋亡，降低转录激活物和细胞周期蛋白D1的表达，并诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9的分裂。在体内实验中，YC-1联合顺铂明显抑制原发性肝癌移植模型肿瘤的生长，其作用同样伴随YC-1对转录激活物和细胞周期蛋白D1的下调和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9的分裂。依赖转录激活物途径，增强原发性肝癌对顺铂的敏感性，为YC-1新的抗癌机制。

3 YC-1的抗炎作用

癌症常伴有长期的慢性炎症，如胃癌伴有胃炎、食管癌伴有食管炎、肝癌伴有乙型肝炎等。YC-1的抗炎作用同样具有抗恶性肿瘤作用。Lu等［10］研究表明，YC-1可抑制炎性反应时脂多糖诱导一氧化氮和前列腺素2的产物，应答脂多糖作用的诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶2的蛋白水平及mRNA也可受到YC-1的抑制。另外，YC-1可减少炎性因子mRNA的表达，如肿瘤坏死因子和白细胞介素1β。在乙型肝炎病毒感染后形成的肝癌细胞中，VEGF、血管生成素1、血管生成素2和金属蛋白酶9都有明显升高的表达，而且血管生成素2和（或）金属蛋白酶9与原发性肝癌切除后的复发有明显相关性。

4 展望

研究已经证实YC-1的具有抗肿瘤作用。目前YC-1在肾脏肿瘤、白血病、子宫肿瘤等领域都有报道，在针对肝癌的研究主要是其对HIF-1和VEGF的抑制作用，动物实验和细胞实验都成功证实YC-1对HIF-1的抑制作用，并发现HIF-1α为VEGF启动调控因子，抑制其表达。鉴于这一作用和VEGF在多种肿瘤中都有表达，YC-1有望成为新的抗癌药物，但仍需进一步研究其药理和毒理作用，探讨对正常细胞的不良反应。对于细胞周期阻滞，YC-1对不同细胞的作用机制不同，对细胞周期的抑制也不同。多途径对细胞周期阻滞，使YC-1的这一作用具有特异性。YC-1的抗炎作用，目前研究有限，抗炎机制在抗肝癌中的作用还不完全明确，有待于进一步探讨。研究YC-1在肝癌发生、发展中的作用，可为肝癌的治疗提供新的途径。

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