Toll样受体与肝纤维化关系的研究进展

何志国(综述)，赵永忠(审校)

(桂林医学院附属医院消化内科，广西桂林541001)

肝纤维化是指肝脏内纤维结缔组织异常增生，是一种“创伤愈合”的慢性渐进性的病理过程。肝细胞损伤后，炎性反应致白细胞聚集于炎症病灶，释放多种炎性细胞因子，如转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、血小板衍生生长因子等，这些炎性细胞因子再激活肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)转化为肌成纤维细胞，释放大量的细胞外基质，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白，这就导致了一个不可逆转的胶原沉积，进而导致肝纤维化［1，2］。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是细胞表面信号转导跨膜受体，在肝纤维化的发生及发展机制中具有重要作用［3］。TLRs在肝脏的库普弗细胞、内皮细胞、树突状细胞、胆管上皮细胞、HSC以及肝细胞等多种细胞上表达。研究表明，在肝免疫细胞和HSC上被激活的TLRs在肝纤维化形成过程中具有重要的作用［4］。

1 TLRs家族

1．1 TLRs及其配体 TLRs家族为固有免疫系统中的保守性膜受体，负责识别多种外源性和内源性配体分子［5］。自1997年Medzhitov等鉴别并克隆出人的一种果蝇Toll同源受体以来，已有13种TLRs在哺乳动物中被确定，人有10种，大鼠有12种［6］。其中 TLR1、2、4、5、6 和 10 表达于细胞表面，活化后迁移至吞噬溶酶体;TLR3、7、8、9表达于细胞内，主要位于细胞内和胞质内质网。TLR是具有类似结构的Ⅰ型跨膜形式识别受体，由胞外区、跨膜区、胞质区三部分组成。胞外区富含亮氨酸重复序列，为550～980个氨基酸组成;跨膜区为半胱氨酸;胞质区存在一段序列保守区，该序列与白细胞介素(interleukin，IL)1受体同源，由约200个氨基酸组成。虽然TLR家族具有相似的结构，但不同的TLR能够识别不同的配体。病原相关的TLR配体可分为 三 类:与 TLR2/TLR1、TLR2/TLR6、TLR4 结合的脂质与脂质蛋白;与TLR5结合的蛋白质;与TLR3、7、8、9 结合的核酸［7］。

1．2 TLRs表达及调控 TLRs活化一方面对微生物迅速作出反应，同时触发适应性免疫应答;另一方面也会因过量的细胞因子及抗原递呈细胞的过度活化而导致疾病。有研究表明，机体可通过诱导负性调节机制特异性干扰TLRs信号转导途径对TRLs表达进行调节，使机体避免免疫系统过度激活而导致损害［8］。其中包括:①诱导产生可溶性TLRs封闭膜表面TLRs与配体的结合。②细胞内负性调节因子(如接头蛋白髓样细胞分化因子)和跨膜蛋白调节因子通过灭活TLRs信号转导途径中的适配分子和酶封闭TLRs活化途径。③泛素化诱导分子，如TLRAD3促进的TLR降解。④TGF-β直接下调TLRs表达。⑤TLRs诱导的凋亡阻止过度炎性反应等影响TLRs表达及功能［8］。

2 TLRs在肝纤维化中的作用

2．1 TLRs与HSC HSC位于肝窦Disse间隙内，胞体呈卵圆形，形状不规则，有数个星状突起。正常情况下其主要功能是储存和代谢维生素A。形态学上可见胞质内数个富含维生素A和三酰甘油的脂滴。此外，HSC还分泌少量的细胞外基质和一定量的基质金属蛋白酶。在肝损伤过程中HSC发生表型转化而激活成为肌成纤维细胞，产生大量细胞外基质促进肝纤维化的形成。业已证实，HSC激活是肝纤维化形成的中心环节。Paik等［9］发现活化的HSC表达TLR4和其辅助受体髓样分化蛋白2和CD14。脂多糖可直接激活HSC，在激活的 HSC中存在完整的TLR4信号通路，脂多糖直接激活HSC表面的TLR4进而激活核因子 κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶通路，诱导炎性细胞因子和黏附分子的表达。脂多糖同时还增强细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1在细胞表面的表达，并诱导活化的HSC分泌趋化因子IL-8和单核趋化蛋白1。如果抑制NF-κB的活性，同时部分抑制c-Jun氨基末端激酶的活性，可以完全阻断HSC分泌IL-8，这表明NF-κB和c-Jun氨基末端激酶在HSC的TLRs信号表达中起关键作用。资料显示，TLR4可上调各类趋化因子(单核趋化蛋白1、巨噬细胞炎症蛋白1α、库普弗细胞、巨噬细胞炎症蛋白1β、调节正常T细胞表达和分泌因子、巨噬细胞炎症蛋白2、干扰素诱导蛋白10)和TLR2的表达，而通过接头蛋白髓样细胞分化因子途径和NF-κB途径下调静止的HSC的TGF-β仿真受体 Bambi(BMP and the activin memebrane-bound inhibitor)来增加TGF-β介导的HSC活化及其胶原的产生［10］。TLR3和TLR4的配体可通过巨噬细胞转接蛋白刺激 HSC 产生 TGF-β［11］，但 TLR3的配体可直接刺激HSC产生TGF-β，而TRL4的配体则无此功能，这提示HSC有不同于巨噬细胞的独特通路即 TLR3/TLR4-TRIF［12］。

TLR9在HSC上也有表达。Watanabe等［13］已经证实，来源于肝细胞凋亡的DNA分子通过TLR9信号通路诱导HSC的分化，随着HSC内的表达，TGF-β和Ⅰ型胶原纤维的mRNA水平升高，来源于肝细胞凋亡的DNA刺激HSC发生纤维化反应。

2．2 TLR4与肝纤维化 TLR4加强HSC和库普弗细胞间的相互作用，加强由TGF-β或者库普弗细胞诱导的HSC的活化，从而促进肝纤维化的发生和发展。TRL4突变小鼠比接受胆管结扎、长期予四氯化碳(CCl4)，或硫代乙酰胺处理的TRL4野生型小鼠更少发生肝脏炎症和纤维化［10］。缺乏CD14和脂多糖结合蛋白的小鼠也显示胆汁性肝纤维化发生率降低［14］。乙醇喂养的小鼠血浆内毒素水平显著增加，可导致肝脏脂肪沉积、坏死和炎症，肝脏受到损伤后，脂多糖水平在肝门脉系统和体循环系统也有明显的增加［15］。在内毒素作用下，一方面肝脏活化的巨噬细胞数量明显增加，伴随氮氧化物合成酶2、环氧化酶2、微粒体前列腺素E合成酶1、IL-1和肿瘤坏死因子α基因的表达;另一方面内皮细胞也发生相同变化，产生细胞因子损害肝细胞。无论是巨噬细胞，还是内皮细胞都通过TLR4信号转导作用最终导致转录因子激活蛋白1和NF-κB转录基因活化［16］。这些结论提示脂多糖与TLR4间的相互作用对肝纤维化的进展具有重要作用。TLR4也可被内源性配体激活，如高迁移率族蛋白B1、透明质酸、热休克蛋白60等［7，15］。但目前没有强有力的证据表明内源性TLR4配体与肝纤维化有相关性，还有待进一步研究。

业已证实，库普弗细胞是TLR4配体脂多糖的靶点，并产生各种炎性及纤维化细胞因子，这些细胞因子可激活 HSC［17］。静止和激活的 HSC都表达TLR4［9，10］。库普弗细胞和 HSC 的 TLR4 在肝纤维化中的具体作用尚不清楚。但有研究显示，胆总管结扎后，TLR4野生型肝脏细胞的小鼠出现明显的肝纤维化，而TLR4突变型肝脏细胞的小鼠表现出肝纤维化显著降低［10］。

2．3 TRL4和TGF-β在HSC的活化中的相互作用

TGF-β是强有力的纤维源性细胞因子。TGF-β可通过以下途径促使肝纤维化的发生:①激活肝内HSC，诱导胶原和其他细胞外基质蛋白的产生;②抑制基质降解蛋白水解酶的合成，促进肝内胶原沉积;③调节HSC储存维生素A的能力，进而调节基质产生;④抑制肝细胞内DNA合成，并可作为调节信号阻止肝细胞再生。目前的研究显示，HSC上的TLR4至少有两种作用:①刺激HSC产生各种趋化因子和黏附分子(细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1、E选择素)，使库普弗细胞和(或)循环巨噬细胞聚集到HSC所在部位，事实上，含脂多糖的HSC条件培养基可增加库普弗细胞迁移和黏附［10］。②TLR4的活化会增强HSCs TGF-β信号表达。在胶原蛋白启动子驱动的绿色荧光蛋白(coll-GFP)转基因小鼠分离的HSC中，绿色荧光强度会随胶原启动子活性增加而增强［18］。单独用 TGF-β处理仅能使静止的HSC胶原蛋白启动子活性轻度升高，而用脂多糖预处理可使TGF-β诱导的HSC胶原启动子活性进一步增强。这些结果表明，TLR4的信号增强了HSC的TGF-β信号［10］，而在库普弗细胞上的TLR4对TLR-4介导的HSC的活化作用并不大，但库普弗细胞作为TGF-β的重要来源是 HSC激活所必需的，因为TGF-β抑制剂处理的库普弗细胞和HSC共培养，HSC活化完全停滞。综上所述，在肝纤维化形成过程中，TLR4信号转导对HSC的激活起着关键作用。

2．4 TRL3与肝纤维化 TRL3识别双链RNA，如多聚肌醇:胞嘧啶核苷酸(Ploy I:C)，诱导产生干扰素-Ⅰ和干扰素-Ⅱ，在由CCl4诱导的肝纤维化模型中，给予TLR3的配体Ploy I:C治疗可抑制肝纤维化的发生［19］。Ploy I:C抑制肝纤维化的发生是通过自然杀伤细胞和干扰素γ起作用的。自然杀伤细胞在Ploy I:C的刺激下对有活性的HSC产生细胞毒作用，而对静止的HSC无反应。Ploy I:C直接或间接通过干扰素γ增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在自然杀伤细胞上的表达，增加自然杀伤细胞对活性HSC的细胞毒作用，抑制肝纤维化的发生、发展。进一步研究证实，依赖Ploy I:C抑制肝纤维化发生的自然杀伤细胞在接受乙醇处理的动物中是被抑制的［20］。这些结果表明，依赖TLR3介导的自然杀伤细胞导致HSC的死亡减少，是酒精性肝病发生肝纤维化的潜在机制之一。

2．5 TLR9与肝纤维化 TLR9可识别细菌的非甲基化CpG-DNA［11］。研究证实，肝纤维化的进展与肠道菌群的移位及其产物有关［10］。资料显示，肝硬化患者和肝硬化大鼠的血浆及腹水中的细菌DNA水平均升高［21］。Watanabe 等［13］指出，在肝纤维化过程中，坏死肝细胞变性的DNA与TLR9结合后可刺激HSCs使肝纤维化加重，而经胆总管结扎和CCl4慢性处理的TLR9基因缺陷大鼠肝纤维化程度则减轻［13，22］，提示细菌 DNA 和来源于机体凋亡细胞的DNA均可作为TLR9的配体，参与肝纤维化的进展。Connolly等［23］已经发现表达 TLR9和 CD11c细胞在肝纤维化过程中发挥重要作用。CD11c在树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达［24］。耗竭CD11c后的大鼠肝纤维化的发生率明显降低，提示表达CD11c的非实质肝细胞在肝纤维化发生过程中具有重要作用［23］。肝纤维化时 CD11c细胞产生肿瘤坏死因子α、IL-6和各种趋化因子的能力增强，在TLR9配体的作用下，这些因子反过来又刺激CD11c细胞进一步表达，但以上现象不存在于正常肝组织中。CpGDNA介导肝纤维化中CD11c阳性细胞的增加，自然杀伤细胞的细胞毒性和细胞因子的产生，包括依赖肿瘤坏死因子α途径干扰素γ的增加。CpG-DNA介导CD11c阳性细胞诱导HSC增殖和炎性介质的产生，如IL-1α、IL-6、单核趋化蛋白1。这项研究显示，TLR9和CD11c阳性细胞在肝纤维化中有重要作用。然而，关于树突状细胞在肝纤维化中的作用还未完全清楚，需要更进一步的研究来阐明。

3 结语

目前认为，肝纤维化的发生是继发于肝脏炎症或细胞损伤后的修复反应，几乎所有的慢性肝脏损害的患者均可发生。近年来，TLRs在肝纤维化的发生、发展中起着重要作用，与肝纤维化的发生、发展密切相关。但目前仍有许多问题需要解决，虽然内毒素血症可促进肝纤维化发生、发展已日渐明确，但内毒素如何通过信号转导系统导致此效应机制仍不清楚。尽管其中的详尽机制并未完全明了，但对其分子机制的进一步研究无疑将为临床上肝纤维化的防治提供新的策略。

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