高效液相色谱法测定清凉膏中盐酸小檗碱含量*

吕游春，刘幸平，张兴德

(南京中医药大学药学院，210046)

清凉膏是名老中医丁泽民教授的经验方，由青黛、血竭、乳香、没药、黄连、冰片等组成，为南京市中医院医院制剂(批准文号:Z04000824)，已应用二十余年，临床疗效佳［1］。但原标准中没有规定含量测定方法，质量控制手段过于简单，制剂质量难以保证。为有效控制制剂质量，笔者以具有清热燥湿、泻火解毒功效的黄连为研究对象，并建立高效液相色谱法［2-3］测定其主要成分盐酸小檗碱含量，为建立该制剂有效的质量控制标准提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SPD-10AVP型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，HH-S型水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)，索氏提取器(东方科仪)。

1.2 试药 清凉膏(规格:每盒30 g，批号:081124)，盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号:110713-200208)。乙腈为色谱纯(MERCK公司)，磷酸为分析纯(南京化学试剂有限公司)，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:AKZONOBEL Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)。流动相:乙腈∶0.1%磷酸(25∶75)，柱温为30 ℃，流速:1.0 mL·min-1，检测波长:345 nm。

2.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品约6.08 mg，精密称定后置100 mL量瓶，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得对照品母液。精密量取2 mL对照品母液置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得浓度为12.16μg·mL-1的盐酸小檗碱对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取清凉膏5 g，精密称定，用滤纸包裹后放入索氏提取器中，加甲醇100 mL，提取4 h后，将提取液过滤浓缩，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度。

2.4 专属性实验 按照处方组成，称取除黄连以外的其余药味并按照制备工艺制成缺黄连的阴性制剂，同供试品溶液的制备方法制备成阴性供试液。精密移取盐酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液、阴性供试液各10μL，按照“2.1”项色谱条件进样，测定，在阴性供试液的色谱图中盐酸小檗碱相应的保留时间(17.487 min)处无色谱峰，说明阴性对照溶液无干扰(图1)。

图1 3种溶液的HPLC色谱图A.阴性对照品溶液;B.盐酸小檗碱对照品溶液;C.供试品溶液;1.盐酸小檗碱

2.5 线性关系考察 取对照品母液，分别稀释成3.04，6.08，12.16，24.32 和 48.64 μg·mL-1对照品溶液，分别精密移取10μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，以峰面积(Y)为纵坐标，以盐酸小檗碱的质量浓度(X)为横坐标，得到线性回归方程:Y=25 352X+36 678(r=0.999 9)。结果表明，盐酸小檗碱在3.04～48.64μg·mL-1范围内，浓度与峰面积有良好的线性关系。

2.6 精密度实验 精密吸取浓度为12.16μg·mL-1盐酸小檗碱对照品溶液10μL，依法测定5次，RSD为1.68%(n=5)。结果表明进样的精密度及仪器精密度均较好。

2.7 稳定性实验 取同一对照品溶液分别于0，2，4，8，12和24 h测定，RSD为2.19%。结果表明样品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性实验 取同批供试品(批号:081124)，平行5份，按供试品溶液同法制备，精密吸取10μL，按“2.1”项下的色谱条件测定。RSD为2.72%(n=5)。

2.9 加样回收率实验 取已知含量重复性项下的样品(批号:081124，含量:29.3 μg·g-1)，平行5 份，分别精密加入浓度为145.92μg·mL-1盐酸小檗碱对照品溶液0.5 mL，按“2.3”项方法处理，具体结果见表1。平均加样回收率100.86%，RSD=1.80%。

2.10 样品含量测定 分别取10批清凉膏制剂约5 g，精密称定，按“2.3”项方法处理样品，照“2.1”项色谱条件进行含量测定，结果10批样品盐酸小檗碱含量分别为 29.1，29.4，30.1，28.3，27.6，28.5，30.6，31.1，30.2，28.1 μg·g-1，平均含量 29.3 μg·g-1。

3 讨论

笔者曾对多种流动相进行实验，结果表明乙腈∶0.1%磷酸为25∶75时，各色谱峰能达到很好的分离且峰形好。制剂样品处理常采用超声提取法、热回流法等常规提取方法，结果发现索氏提取法比较适合样品的处理。此方法使软膏连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶利萃取效率又高。

含量测定时样品常采用高速离心或微孔滤膜过滤等方法进行处理，但由于清凉膏基质中含有凡士林、液体石蜡等油性成分，易溶于有机溶剂，较难除尽，而干扰制剂的含量测定。参考文献的处理方式［4-7］，采用冷藏方法进行脱脂效果较好。

［1］ 郑雪平，王业皇，丁义江，等.清凉膏治疗肿痛型外痔的临床观察［J］.中国中西医结合杂志，2007，27(8):719.

［2］ 马云淑，阮志国，曾德军.黄连解毒滴丸中主要有效成分的含量测定［J］.辽宁中医杂志，2000，27(5):228-229.

［3］ 王静，陆兔林，毛春芹，等.岩黄连药材的提取工艺研究［J］.医药导报，2010，29(3):360-363.

［4］ 尹宁宁，林永强，徐丽华.高效液相色谱(HPLC)法测定冰黄软膏中盐酸小檗碱的含量［J］.中国实用医药，2009，4，(9):145-146.

［5］ 陈万里，史蕙.高效液相色谱法测定肤痔清软膏中盐酸小檗碱含量［J］.贵阳医学院学报，2004，29(2):143-144.

［6］ 管慧，李永江，马建红.高效液相色谱法测定复方黄连软膏中盐酸小聚碱的含量［J］.新疆中医药，2007，25(4):81-83.

［7］ 许明哲，尹利辉，胡昌勤.HPLC法测定他克莫司软膏剂含量及含量均匀度［J］.中国抗生素杂志，2005，30(12):748-751.