兰索拉唑片的生物等效性研究*

张悦，张爱丽，李穆琼，王宝龙，秦向阳，李晓晔，孙晓莉，文爱东

(1.第四军医大学药学系化学教研室，西安 710032;2.第四军医大学西京医院药剂科，西安 710032)

兰索拉唑(lansoprazole)，化学名为2-{［3-甲基-4-(2，2，2-三氟乙氧基)-2-吡啶基］甲基}亚磺酰基-1H-苯并咪唑，是新型的抑制胃酸分泌的药物，它作用于胃壁细胞的H+-K+-ATP酶［1］，使壁细胞的H+不能转运到胃，以致胃液中胃酸量显著减少，临床上用于十二指肠溃疡、胃溃疡、反流性食管炎及佐-艾(Zollinger-Ellison)综合征(胃泌素瘤)的治疗，疗效显著，对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)有抑制作用［2］。兰索拉唑与奥美拉唑结构类似，其药理活性也相似。但兰索拉唑因在吡啶环4位侧链导入氟并有三氟乙氧基取代基，使其生物利用度较奥美拉唑提高＞30%，亲脂性也强于奥美拉唑，因此本品在酸性条件下可迅速地透过壁细胞膜转变为次磺酸和次磺酰衍生物而发挥药效，对Hp的抑菌活性提高为奥美拉唑的4倍［3-5］。笔者对武汉中联集团四药药业有限公司仿制药兰索拉唑建立高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography，HPLC)检测，并研究其生物等效性。

1 材料与方法

1.1 仪器 Dionex summit 680高效液相色谱仪，Dionex P680 HPLC PUMP，Thermostatted Column Compartment， PDA-100 photodiode Array Detector，Chromeleon工作站;H-1微型混合器(上海康禾光电仪器有限公司);超声仪 KUDOS SK8200 LH，离心机Anke TGL-16 C，真空泵(郑州杜甫仪器厂诗圣SHB-3循环水多用真空泵)，S2-93自动双重水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 药品与试剂 兰索拉唑对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100709-200501);受试制剂:兰索拉唑片，武汉中联集团四药药业有限公司，规格:每片30 mg，批号:20090301;参比制剂:兰索拉唑片(可意林)，扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司，规格:每片15 mg。批号:09090601;内标:奥美拉唑(中国药品生物制品检定所，批号:100367-200702)。乙腈、甲醇均为色谱纯(Calepure Promptar Company Ltd.)，磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、乙酸乙酯、三乙胺均为分析纯(天津市富宁精细化工有限公司);实验双蒸水为实验室自制;空白血浆及人体服药后血浆均由第四军大学西京医院药剂科提供。

1.3 色谱条件 色谱柱:Aglient C18(250 mm×5 mm，5μm);柱温:40 ℃;检测波长:285 nm;流速:1.0 mL·min-1;流动相:乙腈-1‰三乙胺水溶液(磷酸调pH至7.0)=30∶70。进样量:20μL。

1.3.1 对照品溶液的配制 精密称取兰索拉唑对照品10 mg，置于10mL棕色量瓶，并用混合液(0.1 moL·L-1碳酸钠溶液∶甲醇=50∶50)溶解定量至刻度线，得浓度为1 mg·mL-1的贮备液。再用混合液稀释成浓度分别为0.10，0.01 mg·mL-1兰索拉唑溶液。

1.3.2 内标液的配制 精密称取奥美拉唑标准品7 mg于10 mL棕色量瓶，混合液稀释至刻度线，振摇得浓度为0.7 mg·mL-1的奥美拉唑溶液。再用甲醇稀释至浓度为0.07 mg·mL-1的内标液。

1.4 受试者选择 20例健康男性志愿者，年龄18～40岁，体质量57.0～66.5 kg，经过体检为健康者。血尿常规、肝肾功能及心电图均正常;无同类药物过敏史;受试者试验前2周不服用其他任何药物;试验期间禁忌烟、酒、茶等;受试者自愿受试且签订知情同意书，并经过第四军医大学西京医院医学伦理委员会批准。

1.5 给药与血样采集 试验采用标准二阶段交叉设计自身对照试验方法。受试者禁食12 h后，清晨空腹给药，用温开水吞服，服药后4 h进统一食谱的标准餐。第一阶段A组服用受试制剂，R组服用参比制剂。受试者口服药物前抽取空白血样4 mL，在服药后0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0和12.0 h分别采集静脉血4 mL，血浆置无菌试管中，于-20℃ 保存。第二阶段A组服用参比制剂，R组服用受试制剂。其余方法与第一阶段相同。全部过程在临床医师的监督指导下进行。

1.6 血样处理方法 精确吸取1 mL血浆样品置10 mL离心管中，加入0.07 mg·mL-1内标20μL及0.01 moL·L-1氢氧化钠、0.1 moL·L-1碳酸钠溶液各100μL，涡旋3 min，静置10 min。移取乙酸乙酯4 mL加入试管内，涡旋混匀 3 min，离心 10 min(3 500 r·min-1)。将上清液全部移取至置洁净试管中，氮气37℃吹干。加入30%乙腈溶液300μL溶解残渣，涡旋混匀1 min，离心3 min(3 500 r·min-1)后取上清液20μL进样分析。

1.7 介质效应试验 递质效应主要用于考察血浆内源性和其他代谢物对样品测定的干扰，以保证待测的物质是预期的分析物。本试验通过考察空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图以及用药后的生物样品色谱图来验证本色谱法的可靠性和准确性。

1.7.1 标品制备 于10 mL离心管中分别加入适量的兰索拉唑贮备液，使之成为浓度为 100，500，1 000 ng·mL-1的溶液，再加适量30%乙腈溶液，使总体积为300μL，混匀，离心，取上清液进样分析。

1.7.2 样品制备 取空白血浆1 mL置于10 mL离心管中，分别加入兰索拉唑贮备液使之浓度为100，500，1 000 ng·mL-1，其余步骤按“1.6”项下处理，进样分析。取患者服药2 h之后的血浆按“1.6”项下处理，进样分析。

1.8 数据处理 两种制剂主要药动学参数血药峰浓度(Cmax)经对数转换后，采用双单侧检验方法统计，达峰时间(tmax)采用Wilcoxon非参数秩和检验。

2 结果

2.1 血浆标准曲线及最低检测限 于空白血浆1 mL中分别加入适量兰索拉唑贮备液，使其浓度分别为50，100，200，400，800，1 600，2 400 ng·mL-1的兰索拉唑溶液，加入内标液20μL，其余步骤按“1.6”项下处理方法进行色谱分析。由图1可见，在本实验条件下，色谱峰峰型好。血浆中的杂质不干扰测定，方法具有较强的专属性。其中兰索拉唑的保留时间为15.8 min，内标的保留时间为7.6 min。以药物与内标峰面积之比(Y)为纵坐标，以所对应各点浓度(X)为横坐标绘制标准曲线。得回归方程:Y=0.000 755X-0.011 320，r=0.999 2。该结果表明兰索拉唑在50～2 400 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系。本测定方法的最低定量下限为50 ng·mL-1。

2.2 精密度实验 取空白血浆1.0 mL，分别加入适量兰索拉唑贮备液，使成为浓度 100，500，1 000 ng·mL-1的兰索拉唑溶液得血浆样品各数份，按前述血浆样品处理方法，于1 d内测定，得日内精密度RSD分别为3.7%，0.4%，0.6% 。于不同日反复测定，得日间精密度RSD分别为4.4%，2.9%，1.2% 。

图1 3种血浆的HPLC色谱图A.空白血浆;B.空白血浆加对照品及内标;C.服用兰索拉唑片2 h后血浆;1.奥美拉唑;2.兰索拉唑Fig．1 HPLC chromatograms of 3 kinds of plasmas sam p lesA.blank plasma;B.blank plasma spiked with reference substance and internal standard;C.plasma sample at 2 h after administration of lansoprazole;1.omeprazole;2.lansoprazole

2.3 稳定性实验 兰索拉唑血浆样品分别在室温放置6，8，12，24 h 及2，3 d，反复冻融后操作，保持稳定，含量保留百分数平均值为93.47%。本实验在血浆测定过程中，于每日平行测定低、中、高3种浓度的质控样品，其测得值在真实值的±10%范围内。

2.4 介质效应 由图1可知，本实验建立的色谱分析法能有效保证样品与内源性物质和代谢物的完全分离，适用于兰索拉唑的药动学研究和临床用药监测。

2.5 药动学参数 对数据的处理结果表明，20例健康志愿者服用受试制剂后血药浓度-时间曲线下面积(concentration-time area under the curves，AUC)的 90%可信限落在参比制剂80.0% ～125.0%范围内，Cmax的90%可信限落在参比制剂70.0%～143.0%范围内，tmax经Wilcoxon符号秩和检验差异无统计学意义。受试制剂与参比制剂各主要药动学参数间均差异无统计学意义(P＞0.05)，受试制剂对参比制剂的生物利用度为(95.6±32.8)%，在人体内具有生物等效性。志愿者服用两种制剂后的平均血药浓度-时间曲线图见图2，主要参数见表1。

表1 健康受试者口服兰索拉唑后的药动学参数Tab．1 The pharmacokinetic parameters of the healthy volunteers after oral adm inistration w ith lansoprazole tablets±s

表1 健康受试者口服兰索拉唑后的药动学参数Tab．1 The pharmacokinetic parameters of the healthy volunteers after oral adm inistration w ith lansoprazole tablets±s

制剂 例数C max/(ng·mL-1)t max/h AUC0-12 h/(μg·h·mL-1)AUC0-∞/(μg·h·mL-1)t1/2/h受试制剂 20 854.82±249.70 2.82±0.69 3 779.90±1 191.52 4 078.54±1 171.17 2.38±0.48参比制剂 20 813.22±289.59 2.52±0.80 3 513.00± 742.25 3 742.64± 749.85 2.19±0.49

3 讨论

3.1 色谱条件 目前，国内外文献报道的有关本药血浆浓度的测定方法较多，有电喷雾串联质谱法［6］，不常用;也曾尝试过用荧光检测器、蒸发光散射法，但效果不好，经摸索选定了紫外检测法。流动相尝试过甲醇∶水，甲醇∶乙腈，甲醇∶碳酸盐缓冲液，经比较表明甲醇∶乙腈(30∶70)分离效果较好，在加入1‰三乙胺溶液之后，峰型明显改善。尝试酸性条件下pH=2.0分离效果并不好，而在pH=7.00±0.02、柱温为40℃时效果最好。内标曾选择对羟基苯甲酸乙酯、泮托拉唑等［7］，后证实用奥美拉唑作为内标，能呈现较好的分离效果，出峰时间合适。

3.2 样品处理方法 兰索拉唑见光易分解，需避光保存样品溶液，且保存在-4℃冰箱中。提取样品时，笔者参考过不同的溶剂提取方法，有乙醚-二氯甲烷［8］、二氯甲烷-乙酸乙酯［9］，操作过程较繁琐，提取率较低，杂质较多。实验结果证明乙酸乙酯分离提取的效果最佳。乙酸乙酯单次提取与多次提取实验差异无统计学意义。

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