没食子中没食子鞣质的提取工艺及免疫作用研究*

范晓红，李治建，斯拉甫·艾白，3，刘发，周露，孟繁龙

(1.新疆石河子大学药学院，832000;2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐 830049;3.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，乌鲁木齐 830049)

没食子(Turkish galls)为壳斗科植物没食子树(Quercus infectoria oliv.)幼树上的虫瘿，由没食子蜂(Cynips gallae-tinctoriae oliv.)寄生而形成。药材主要药用成分为没食子鞣质、没食子酸等活性成分。没食子中富含没食子鞣质，没食子鞣质具有多方面药理活性，具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫调节等作用［1-3］。没食子鞣质极不稳定，容易在酸、碱、酶的催化作用下水解，不同溶剂和不同提取方法直接影响没食子鞣质的药效。笔者对没食子鞣质的提取分离进行了初步优选，以没食子酸提取率为指标，建立简便、准确的高效液相色谱(HPLC)法含进行量测定。通过比较不同方法提取没食子鞣质对小鼠淋巴细胞增殖反应和对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响的研究，分析没食子鞣质的最佳提取工艺，为没食子的开发利用提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪:Waters1525二元泵高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器，Empower数据采集系统(美国);Shim-pack VP-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm);MCO-175二氧化碳(CO2)培养箱;XD-101倒置显微镜;550-BIORAD酶标仪(美国)。

1.2 试药 没食子药材品种由新疆维吾尔自治区药品检验所中药室鉴定;没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110831-200803);甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 没食子鞣质提取工艺研究

2.1.1 水和80%丙酮浸泡提取 取过孔径250μm(4号)筛没食子药材粉末两份，每份50 g，加水和80%丙酮室温浸泡提取3次，水提取每次30 min，丙酮提取每次浸泡2 d。提取液合并减压浓缩，真空干燥后，加适量水混悬，用乙醚提取，水层部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，真空干燥，干燥温度不超过50 ℃［4-5］。

2.1.2 甲醇超声提取 没食子粉末(过孔径250μm筛)50 g经70%甲醇超声处理1 h，室温避光浸泡24 h，提取3次。合并滤液，减压浓缩，真空干燥得浸膏，加适量水混悬，用乙醚提取，水层部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，得浸膏［6］。

2.1.3 乙醇搅拌提取 取干燥的没食子粉末(过孔径250μm筛)50 g，置棕色瓶中，经50%乙醇室温搅拌提取1 h，提取3次，减压浓缩，回收乙醇。真空干燥后加适量水混悬，用乙醚提取，水层部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，得浸膏［7］。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相:A相:0.2%磷酸(H3PO4)溶液;B相:甲醇(CH3OH)，A∶B=90∶10，柱温:30℃检测波长:275 nm，进样量10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥恒重的没食子酸对照品25.0 mg，置50 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度(每毫升中含没食子酸0.50 mg)。

2.2.3 供试品溶液的制备 取精密称取原药材粉末(过孔径250μm筛)、甲醇提取物、丙酮提取物、水提取物、乙醇提取物各0.5 g，加入4 mol·L-1盐酸溶液50 mL，水浴中加热，水解3.5 h，定容至100 mL(原药材要经过滤之后定容)，后精密称取2 mL，置250 mL棕色量瓶中，加水至刻度，摇匀即得样品溶液［8］。

2.2.4 样品含量测定 样品溶液和对照品溶液分别用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤后，分别进样10μL，注人色谱柱，按上述色谱条件测定。以外标一点法计算各样品中没食子酸的含量。

2.2.5 线性关系的考察 精密量取对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置25mL 棕色量瓶中，用孔径0.45μm滤膜滤过，进针上样。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得回归方程Y=28 574X-51 114，r=0.999 7，没食子酸在 10.32 ～103.20μg线性关系良好。

2.2.6 方法学考察 精密度实验:在“2.2.1”项条件下，精密吸取没食子酸对照品溶液10μL，连续进样6次，峰面积的RSD=1.8%，表明仪器精密度良好。

重复性实验:精密称取干燥没食子，按“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别测定没食子酸的含量，RSD=1.6%(n=6)，证明此方法精密度良好。

稳定性实验:取室温下放置的样品溶液，在15 h内进样6次，其峰面积的RSD=1.9%，表明样品溶液在室温下15 h稳定。

加样回收率实验:取已知含量的样品5份，每份约20 mg，分别精密加入没食子酸对照品溶液(浓度为0.05 mg·mL-1)10 mL，超纯水溶解定容至25 mL棕色量瓶中即得。分别进样10μL，测定，计算平均回收率为101.76%，RSD为1.9%(n=5)。

2.3 不同提取方法提取没食子鞣质对小鼠免疫功能的作用

2.3.1 对小鼠淋巴细胞增殖的影响 脾细胞悬液制备［9］:在无菌条件下取小鼠脾脏，用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，然后放在细胞过滤筛上，用塑料注射器芯研碎脾脏，培养液冲洗获取单细胞悬液。制备好后用培养液调节细胞浓度为(1～5)×106个·mL-1。

淋巴细胞增殖反应［10］:将细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100μL，再在各孔中加入不同浓度药物100μL，每个浓度做5个平行，对照组加培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养66 h后，取出，根据噻唑蓝比色法测定生存细胞活性，在培养结束前4～6 h，向每孔中加入5 mg·mL-1噻唑蓝溶液10μL，继续孵育4 h，离心(1 000 r·min-1，r=15 cm，10min)后，轻轻吸弃上清液，加入二甲亚砜溶液100μL，稍震荡，用酶标仪于波长570 nm处测定吸光度(A)值。

对刀豆蛋白(concanavalin A，ConA)诱导的淋巴细胞增殖反应:将细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100μL，再在各孔中加入100μL不同浓度药物，每个浓度做5个平行，最后加Con A溶液20μL，溶剂对照组为培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养66 h后，取出，根据噻唑蓝比色法测定存活细胞活性。

2.3.2 没食子鞣质对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 小鼠腹腔巨噬细胞的制备参照文献［10］，制备好的细胞用培养液调节细胞浓度至3×106个·mL-1。再以每孔100μL细胞悬液接种于96孔培养板，置37℃、CO2培养箱中培养3 h。弃上清液，用培养液洗去未贴壁细胞，培养孔内为腹腔巨噬细胞。每孔加培养液100μL，继续培养。按下列分组加样，空白对照组加培养液100μL，加药组加100μL(终质量浓度为100，50，25 μg·mL-1)，置培养箱中培养 24 h 后，弃上清液，加 0.075%中性红溶液，每孔 100μL，培养30 min后，以磷酸盐缓冲溶液洗3次，加醋酸-乙醇(1∶1)细胞溶解液，每孔100μL，于4℃静置过夜，用酶标仪在570 nm波长处测A值。

3 结果

3.1 不同提取方法对没食子鞣质提取效果的影响用HPLC方法测定提取物中没食子酸提取率，结果见表1。从表1可以看出，70%甲醇超声提取没食子酸提取率最高，对没食子鞣质的提取效果最佳。

表1 不同提取方法样品没食子酸含量测定和提取率结果Tab．1 The content determ ination and extraction rate of gallic acids in samples by different technology%± s，n=3

表1 不同提取方法样品没食子酸含量测定和提取率结果Tab．1 The content determ ination and extraction rate of gallic acids in samples by different technology%± s，n=3

提取方法 溶剂 水解后没食子酸含量没食子酸提取率浸泡 水22.23±1.77 62.24±2.12浸泡 80%丙酮 21.82±1.93 61.43±2.65超声 70%甲醇 27.32±2.05 77.01±2.97搅拌 50%乙醇23.76±2.10 66.95±2.17

原药材水解后没食子酸平均含量为35.47%，没食子酸的提取率(%)=提取出的没食子酸含量/药材水解后没食子酸的含量×100%。

3.2 不同提取方法提取没食子鞣质对小鼠免疫细胞的作用

3.2.1 对小鼠淋巴细胞增殖的影响 见表2。可知，没食子鞣质对小鼠的脾淋巴细胞转化A差值均大于空白对照组，水浸泡提取物、甲醇超声提取物和乙醇搅拌提取物经萃取得到的没食子鞣质浓度为20μg·mL-1时均能不同程度地增强小鼠脾淋巴细胞增殖反应，丙酮浸泡提取物萃取得到的没食子鞣质浓度在40μg·mL-1增强了小鼠的脾淋巴细胞增殖反应。

3.2.2 对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响见表3。可知，没食子鞣质对ConA诱导小鼠的脾淋巴细胞增殖具有促进作用，4种提取物浓度在所试范围内均能不同程度地增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应，乙醇搅拌提取物和丙酮浸泡提取物萃取得到的没食子鞣质浓度在40μg·mL-1就能明显增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应。

3.2.3 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 采用小鼠腹腔巨噬细胞体外培养吞噬中性红实验，结果见表4。可见不同提取方法提取没食子鞣质在4.7～18.8μg·mL-1的质量浓度范围内均能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力，但吞噬细胞的吞噬功能各组间差异均不显著。

4 讨论

没食子有效成分主要是鞣质类的成分，没食子鞣质是复杂多元酚类的混合物，相对分子质量较大，极性强，性质较为活泼，在提纯过程中，容易发生氧化、水解等化学反应。鞣质通常用极性溶剂进行提取，为了减少杂质，多采用不加热的提取方法。笔者采用该法测定总鞣质的含量，与经典的鞣质含量测定方法相比，HPLC法为鞣质定量分析开辟新的前景，鞣质在酸性条件下水解为没食子酸，以没食子酸含量为指标检测鞣质含量，结果准确有效、重复性好。

表2 不同工艺没食子鞣质对小鼠淋巴细胞增殖的影响(A值)Tab．2 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation(A)±s

表2 不同工艺没食子鞣质对小鼠淋巴细胞增殖的影响(A值)Tab．2 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation(A)±s

与对照组比较，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

组别 剂量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取没食子鞣质组 20 0.329 ±0.037*1 0.276±0.025*1 0.246±0.020 0.310 ±0.030*1 40 0.337 ±0.034*1 0.348±0.034*1 0.321±0.062*1 0.337 ±0.034*1 80 0.397 ±0.061*2 0.341±0.040*2 0.370±0.037*2 0.352 ±0.039*2对照组 0 0.275±0.028 0.223±0.021 0.240±0.016 0.205±0.038

表3 不同工艺没食子鞣质对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响(A值)Tab．3 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation induced by ConA(A)±s

表3 不同工艺没食子鞣质对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响(A值)Tab．3 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation induced by ConA(A)±s

与对照组比较，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

组别 剂量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取没食子鞣质组 20 0.283±0.027 0.235±0.020 0.216±0.032 0.266±0.051 40 0.291±0.030 0.242±0.044 0.276±0.042*1 0.297 ±0.030*1 80 0.317±0.039*2 0.283±0.022*2 0.316 ±0.031*2 0.349 ±0.038*2对照组 0 0.258±0.041 0.223±0.022 0.219±0.030 0.248±0.033

表4 不同工艺没食子鞣质对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(A值)Tab．4 Effects of gallotannins extracted by different technology on phagocytosis ofmouse peritonealmacrophages(A)±s

表4 不同工艺没食子鞣质对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(A值)Tab．4 Effects of gallotannins extracted by different technology on phagocytosis ofmouse peritonealmacrophages(A)±s

与对照组比较，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

组别 剂量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取没食子鞣质组 4.7 0.158±0.023 0.163±0.034 0.133±0.029 0.137±0.032 9.4 0.184±0.034*1 0.193±0.034*1 0.137±0.024 0.203±0.052*1 18.8 0.226±0.041*2 0.232±0.012*2 0.172±0.025*2 0.220±0.017*2对照组 0.0 0.133±0.011 0.136±0.013 0.102±0.030 0.147±0.011

免疫增强药物可能在机体免疫过程的不同环节起作用，文献报道没食子鞣质类可以增强机体非特异性免疫功能。筛选研究影响免疫功能的药物时，影响免疫功能的研究方法较为复杂，近年来进展也较快。笔者采用体外方法检测淋巴细胞增殖实验，结果表明，没食子鞣质有协同ConA诱导脾淋巴细胞增殖作用。实验表明没食子鞣质也能促进无丝裂原刺激的脾淋巴细胞增殖，说明没食子鞣质本身就可以启动淋巴细胞表面受体活化，具有丝裂原的刺激作用。该方法虽然不能反映淋巴细胞的全部功能，但可代表影响淋巴细胞活化的事实。以小鼠腹腔巨噬细胞在体外吞噬中性红为指标，发现不同提取方法提取没食子鞣质可使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能明显增加。本研究提示，没食子鞣质能显著增强小鼠特异性免疫和非特异性免疫功能，但能否全面增强机体免疫功能还有待进一步研究。

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