新生儿溶血病实验室检测研究进展

黄瑞英

广西桂平市中医院检验科 537200

新生儿溶血病(hemolytic disease of newborn,HDN)主要是指母婴血型不合、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、丙酮酸激酶缺乏、地中海贫血、球形红细胞增多症而产生同族血型免疫反应的遗传性疾病。当胎儿从父亲继承的红细胞抗原恰为母亲所缺乏时,胎儿红细胞作为一种异抗原通过“胎盘出血”进入母体后,刺激母体产生相应的血型抗体,产生免疫抗体,通过胎盘绒毛膜进入胎儿血循环与胎儿红细胞凝集、使之破坏而出现溶血,引起贫血、水肿、肝脾肿大,严重者发生核黄疸甚至造成新生儿死亡。目前已发现人类有26个血型系统、400多个血型。每个血型系统在遗传上都是独立的,并按孟德尔法则遗传。引起新生儿溶血病以的ABO系统为最多,次为 Rh系统,其他如 MN、Kell、Duffy系统等血型不合引起的本病较少见。新生儿溶血病严重危害新生儿健康,容易造成新生儿终身与疾病相伴,所以新生儿溶血病一直以来都受到妇幼医疗学界的重视,随着医学技术的发展,目前新生儿溶血病的检测和临床治疗手段有了很大的进步,其痊愈率也在不断上升,笔者对新生儿溶血病的发病原因、临床表现及实验室检查综述如下。

1 新生儿溶血病的发病原因

1.1 Rh血型不合 Rh血型不合引起的新生儿溶血症在我国的发病率较低。通常是母亲为Rh阴性,胎儿为Rh阳性而血型不合,并引起溶血,一般第一胎不发病,而从第二胎起发病,但如果Rh阴性的母亲在第一胎前曾接受过Rh阳性的输血,则第一胎也可发病。

1.2 ABO血型不合 本病以ABO血型不合最常见,其中最多见的是母亲为O型,胎儿(或婴儿)为A型或B型。第一胎即可发病,分娩次数越多,发病率越高,且一次比一次严重。尚可见于母亲为A型,胎儿(或婴儿)为B型或 AB型,母亲为B型,胎儿(或婴儿)＞为B型或AB型,但少见。胎儿(或婴儿)为O型者,可排除本病。当然,不是所有母婴血型不合的条件都会发生溶血,这和胎盘的致密程度、抗体的数量等多种因素有关。Rh血型不合溶血多发生在第二胎,或孕妇以前接受过输血。这种情况下胎儿多在宫内即发生了溶血,因此生后黄疸出现较早,进展快,而且多伴有贫血、水肿、肝脾增大;而ABO血型不合第一胎即可发病,但病情与Rh溶血相比较轻,病情发展也相对缓慢[1]。

2 新生儿溶血病的临床表现

2.1 胎儿水肿 严重者表现为胎儿水肿,主要发生在Rh溶血病,在胎儿期有大量红细胞破坏,患儿全身水肿、苍白、皮肤淤斑、胸腔积液、腹水、心音低、心率快、呼吸困难、肝脾肿大。胎盘也明显水肿,胎盘重量与新生儿体重之比可达1∶(3～4),严重者可发生死胎。

2.2 黄疸 溶血病患儿黄疸出现早,一般在生后24h内出现黄疸,并很快发展,血清胆红素以未结合胆红素为主。但也有少数患儿在病程恢复期结合胆红素明显升高,出现胆汁黏稠综合征。部分ABO溶血病黄疸较轻,与生理性黄疸相似。

2.3 贫血 溶血病患儿有不同程度的贫血,以Rh溶血病较为明显。如血型抗体持续存在可导致溶血继续发生,患儿在生后3～5周发生明显贫血(Hb＜80g/L),称晚期贫血,多见于未换血者和已接受换血的早产儿中。

2.4 肝、脾肿大 严重病例因髓外造血,出现肝、脾肿大。

2.5 胆红素脑病(bilirubin cerebritis) 新生儿溶血病可发生胆红素脑病,足月儿胆红素超过18mg/dl,早产儿胆红素超过12～15mg/dl就要警惕发生该病。开始表现为神萎、吸吮反射和拥抱反射减弱、肌张力低下,12h～1d,如病情进展,出现发热、两眼凝视、肌张力增高、抽搐、角弓反张等,可因呼吸衰竭或肺出血死亡。

3 实验室检查

3.1 ABO血型及Rh血型鉴定

3.1.1 ABO血型正反定型:根据红细胞膜表面有无A抗原和(或)B抗原,将血型分为A型、B型、AB型及O型4种,可利用凝集试验,通过正反定型准确鉴定ABO血型。所谓正定型是指用标准抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或(和)B抗原;所谓反定型是指用标准A型红细胞和B型红细胞来测定血清中有无相应的抗A和(或)抗B。可采用采用玻片法或试管法进行鉴定。

3.1.2 Rh血型鉴定:从理论上讲人类红细胞上的Rh抗原应有 C 、c、D、d、E 、e 6种 ,但目前尚未发现抗d,因此也未肯定抗原,Rh抗原主要有5种。Rh血型形成的天然性抗体极少,主要是免疫性抗体,已知有抗 D 、抗E 、抗C、抗 c、抗e抗体等5种。抗 D抗体是Rh血型系统中最常见的抗体。Rh抗体有完全抗体和不完全抗体两种,完全抗体在机体受抗原刺激初期出现,一般属于IgM型。机体再次受抗原刺激,则产生不完全抗体,属于IgG型。Rh抗体主要是不完全抗体,如用5种不完全抗体的血清(抗D 、抗E 、抗 C 、抗c、抗 e)做鉴定,可将 Rh血型系统分为18个型别。在临床上,因D抗原的抗原性最强,出现频率高,临床意义又较大,故一般只做D抗原的血型鉴定。如仅用抗D血清进行鉴定,则凡带有D抗原者称为Rh阳性,不带D抗原者称为Rh阴性。

3.2 母亲IgG抗体效价测定 胎盘对抗体的吸收是选择性的,IgG是唯一能穿过胎盘的免疫球蛋白,并且IgG通过胎盘是一个主动转运的过程,在妊娠24周时胎儿体内的IgG浓度约为1.8g/L,足月时脐带血中IgG水平可比母亲高20%～30%,约为15.12g/L[2,3]。一般孕妇血清中IgG抗体效价的高低与胎儿受害程度呈正相关[4],因此,产前检测孕妇血清中的IgG抗体效价对预防HDN的发生有重要的价值。胡雄燕[5]等认为:当母体IgG抗体效价≥1∶64时就有临床意义,母体血清IgG抗体效价与新生儿溶血病的发生率成正相关,动态监测孕妇血清IgG抗体效价升高2个或2个以上滴度时,新生儿溶血病发生率可达73%。因此,当丈夫为非O型血的O型血孕妇,应常规进行IgG抗体(抗A、抗B)效价检测,在初次检测到母体IgG抗体(抗A、抗B)效价较高时(≥1∶64),应严密追踪观察,当抗体效价≥1∶256时,应进行产前综合治疗[6],如静脉注射免疫球蛋白。当然,有些特殊的病例当母体IgG抗体效价较高时却没有发生新生儿溶血病,一般认为可能与胎儿A、B抗原的强弱、胎盘的屏障作用强以及胎儿红细胞上的致敏抗体的量和IgG亚群有关。IgG亚群中溶血性最强的是IgG3[7,8]。

3.3 IgG亚类的检测 众所周知IgG重要的生物学活性为特异性结合抗原,并通过重链C区介导一系列生物学效应,包括激活补体、亲和细胞而导致吞噬、胞外杀伤及免疫炎症,最终达到排除外来抗原的目的,其中补体活化作用是关键的一步。IgG抗体有4个亚类 IgG1、IgG2、IgG3和 IgG4,各亚类与红细胞结合后激活补体的能力顺序为IgG1＞IgG3＞IgG2,当新生儿红细胞上结合IgG2和IgG4时不发生溶血,只有结合IgG1和 IgG3时才发生溶血。IgG3和IgG1破坏红细胞的能力不同,IgG3在介导单核细胞破坏抗体致敏红细胞方面的能力比IgG1要强。在子宫内,IgG1抗-D引起HDN比IgG3抗-D更能导致严重的贫血,但它们进入胎儿血循环后,IgG3对红细胞的破坏更为严重[9～14]。因此有必要进行母亲产前血清IgG亚类检测。

3.4 直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test,DAGT) 直接试验应用抗人球蛋白试剂(抗IgG和/或C3d)与红细胞表面的IgG分子结合,如红细胞表面存在自身抗体,出现凝聚反应,即产生新生儿同种免疫性溶血。赵建萍[15]等认为DAGT用于新生儿溶血病诊断敏感性较低,结合其他试验进行诊断更可靠。

3.5 游离抗体试验 新生儿血清中的IgG抗A(B)来自母亲,因此,如果在新生儿血清中发现有与其红细胞不配合的IgG抗A(B)时,表明婴儿可能受害。将待测新生儿血清分别放入三支试管,分别加入5%A、B及O型红细胞盐水悬液1滴,37℃致敏1h后取出,若致敏后已发生凝集,说明存在相应抗体。游离抗体检测血中游离抗体用于判定是否存在继续溶血,在治疗效果的观察和病情发展的评估上有实际意义。游离抗体要及时检测,患儿出生时间越短检测阳性率越高。出生0～4d检测阳性率最高,这是因为在发病24h内抽样检测,新生儿血液中还有较多的游离IgG血型抗体及致敏红细胞存在的缘故,在发病24h后随着发病时间的延长,检测率越来越低,这是由于新生儿血液中只有少量的游离IgG血型抗体及致敏红细胞存在,而大部分IgG血型抗体以游离的抗原抗体复合物的形式存在,失去了反应原性[16]。

3.6 放散实验 也称释放试验,致敏的患儿红细胞通过加热将抗体放散于放散液中,然后再加入酶处理的成人相应红细胞致敏,红细胞上的抗原与血清中抗体在适合条件下发生凝聚或致敏。这种结合是可逆的,如果改变某些物理条件时,抗体又可以从结合的细胞上解脱下来。这种方法称为放散实验。先利用特殊的方法将致敏在新生儿红细胞上的抗体放散下来(ABO血型不合时加热放散、Rh血型不合时乙醚放散),然后再检测放散液中的抗体,当放散液中检出抗体,同时新生儿红细胞上又存在相应抗原时,认为释放试验阳性。研究结果证实释放试验是“三项试验”中敏感度最高,也是判定HDN最有力的证据[17]。

3.7 血清总胆汁酸(TBA)测定 血清总胆汁酸水平是唯一可同时反映肝脏分泌状态,肝脏合成与代谢及肝细胞损伤三方面的血清学指标。末梢血中TBA仅为1mg/L,当胆汁排出受阻或肝功能受损,血中TBA浓度很容易升高。结果显示,在生理性黄疸患儿中TBA只有少数的增高,而病理性黄疸患儿的 TBA大多数增高。所以在治疗中进行HDN患儿胆红素监测,很有必要对血清TBA进行测定,以指导临床用药及观察疗效[18]。

4 新生儿溶血病免疫血液学实验室检测方法

4.1 抗人球蛋白法 HDN的免疫血液学检查主要是检测母体针对胎儿的免疫性抗体IgG,包括检测孕母体内IgG型抗体效价及检测新生儿红细胞被IgG抗体致敏情况。采用试管抗人球蛋白法,较灵敏,结果可靠。

4.2 微柱凝胶技术 微柱凝胶抗人球蛋白试验的原理是孕妇IgG类抗体致敏的红细胞和微柱内的抗人球蛋白结合而发生凝集,不能通过凝胶微粒间隙,离心后红细胞不能达到微柱底部;而未被IgG类抗体致敏的红细胞不与微柱内的抗人球蛋白结合,离心后红细胞通过凝胶微粒间隙达到微柱底部[19]。微柱凝胶技术是建立在传统血型血清学基础上的一项免疫学检测技术,将凝胶分子筛技术与免疫学技术相结合,在离心力作用下抗原和抗体反应后或抗体致敏凝集红细胞留在微柱上端或分布在凝胶中,未凝集或未致敏红细胞通过间隙到达微柱底部,形成不同强度的凝集反应[20]。微柱凝胶抗人球蛋白试验是一种新兴的试验方法,具有简便、快速、省时、省力,结果易于观察,反应结果稳定,易于保存,并可以拍照长期保存图谱等优点[21]。

4.3 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 通过检测孕妇和新生儿体内免疫性抗体IgG亚类判断新生儿溶血程度越来越引起人们的关注,抗人球蛋白法只能检测血液中总的IgG水平,检测IgG亚类需要更为精确的方法,现阶段国内主要采用ELISA法[22]。ELISA法操作简单,易于普及,但是存在一定的不足。首先影响ELISA法检测的因素较多,酶标本身不稳定,易受温度和酸碱度变化的影响[23]。并且该方法是间接测量致敏红细胞结合相关抗体的方法,为半定量法,定量欠精确。

4.4 单核单层检测(monocyte monolayer assay,MMA) MMA是体外功能细胞实验,是一类评估抗体临床意义的试验。MMA检测方法是根据致敏红细胞在体内免疫反应而设计的体外模拟实验,在国外该检测方法已作为临床诊断新生儿溶血病一个常规辅助诊疗手段[24]。

4.5 流式细胞术(FACS) FACS是近年广泛应用的细胞自动分析分选技术,它可以快速测量悬浮于液体中的分散细胞的一系列生物物理和生物化学特征性参量,并根据预定的参选范围把指定的细胞亚群分选出来。FACS可以用于抗体致敏红细胞的检测,在IgG抗体经试剂红细胞吸附后,用于血液中IgG抗体的检测[25,26]。由于每个荧光标记抗人IgG分子可带有15～20个荧光基团,因此一个红细胞只要结合几个抗体分子,就足以被流式细胞仪检出,极大地提高了试验的灵敏度。

综上所述,HDN主要由母婴血型不合引起,随着分子生物学不断发展,并不断应用于临床实践,新生儿溶血病的检查技术和方法也越来越多,如PCR技术也开始广泛应用于HDN的诊断,只有早检查,及时诊断和治疗,治愈率也较高,神经系统后遗症也较少。

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