β-防御素及其与呼吸道疾病关系研究*

赵文娟 陈文慧 姚 政 陈 滟

云南中医学院基础医学院,云南省昆明市 650500

防御素是一类广泛存在于皮肤和黏膜上皮组织中具有广谱抗微生物活性的小分子多肽。近年来发现防御素不仅通过直接杀菌作用抵御入侵机体的病原微生物,还在介导获得性免疫反应、调节机体的免疫炎症反应和创伤修复过程中起着重要作用,是机体免疫系统的重要组成部分。因此,对于它的研究目前越来越受到人们的广泛关注。

1 β-防御素的发现

防御素是抗菌肽家族中最大的亚家族,是一类重要的内源性抗菌肽。已从脊椎动物体内分离出许多防御素,根据其空间结构不同可分为3大类:α-防御素 、β-防御素 、θ-防御素 。 其中,β-防御素是 1991年Diamond等[1]首次在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的短肽,命名为 TAP(tracheal antimicrobial peptide),后来又在牛的粒性白细胞中发现了13种与TAP的序列高度同源的短肽,但其consensus序列与α-防御素不同,故被命名为β-防御素。人的β-防御素(Human β-defensin,HBD)目前已发现有 6种(HBD1～6)。人的第1种β-防御素(HBD-1)最初是在血液中发现,人的第 2种β-防御素(HBD-2)是由角蛋白产生,从牛皮癣患者的皮肤中发现的,随后又发现在肾、尿液、宫颈黏液、下颌唾液腺、胰腺、气管、前列腺、胎盘、睾丸、胸腺及小肠细胞中都有HBD-2的表达。2000年 Harder等[2]从银屑病患者的皮损组织中发现了人的第3种β-防御素(HBD-3),并采用金黄色葡萄球菌亲和柱进行了分离纯化,从蛋白水平上发现了HBD-3。通过局部比对搜索工具(BLAST),发现了另外3种β-防御素(HBD4～6)。

2 β-防御素的分子结构

成熟的β-防御素包含36～50个氨基酸残基,包括6个半胱氨酸残基(Cysl-5,2-4,3-6)以独特的空间模式形成二硫键,与 α-防御素相区别。Cys2-Cys4桥在多肽核内引入环状共价链。β-防御素分子内含3个反向平行的β-折叠链,由3个分子内二硫键连接。β-片层与一个可变长度的α-螺旋片段连接,形成分子N末端片段。α-螺旋和β-片层的连接位点是通过二硫键来稳定的(Cysl-Cys5)。β-防御素有形成多种低聚结构的潜能 ,这些低聚结构影响着防御素蛋白的生物学活性和功能[3]。

3 β-防御素的生物学活性

3.1 抗菌活性 β-防御素抗菌谱较广,是机体抵御外界微生物侵袭的第一道化学屏障。在机体固有免疫防御中发挥重要作用。β-防御素能广泛杀灭G+菌和G-菌,体外试验表明,β-防御素能够抑制大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母等,除了对肺炎克雷伯氏菌没有明显的抑制效果外,对以上几种病原菌和热带白假丝酵母有抑菌作用,两者的最低作用浓度(MIC)为6～50mg/ml[4]。一般认为β-防御素的直接杀菌机制是由于该分子带正电,能与带负电荷、呈阴性的细菌表面结合,结合后其分子中的疏水区可插入到细菌胞膜,而带电区(带正电荷)则与细胞膜上带负电荷的磷脂头部以及水分子相互作用。在细胞膜上多个β-防御素分子聚集形成孔隙或道。使正常情况下处于胞外的离子、多肽等流入胞内,而胞内重要的盐类、大分子等泄漏到胞外,造成物质泄漏,最终导致不可逆性的菌体死亡[5]。

3.2 抗其他病原生物的活性 β-防御素能杀灭一些被膜病毒,如人类免疫缺陷病毒、疱疹病毒、水泡型口炎病毒、流感病毒等,但对无衣壳病毒却无效。β-防御素对病毒的杀灭作用依赖于其分子内二硫键的紧密程度、防御素的浓度等因素,还与pH值、温度等因素有关,在中性及低离子强度条件下,防御素具有较强的抗病毒活性[6]。此外,β-防御素对某些真菌、梅毒螺旋体和钩端螺旋体、分枝杆菌等均有很强的抗菌活性,β-防御素还能有效地杀死引起人类及动物寄生虫病的病原体,如疟疾、chagas氏病、利什曼病的病原体。1998年,Shahabuddin研究发现防御素对疟原虫感染蚊子的不同时期有不同的作用。疟原虫的卵囊期和子孢子期较其他时期对防御素敏感,而且防御素对疟原虫卵囊期的损伤有时间依赖性,一般感染3d后,卵囊密度明显降低[7]。

3.3 抗肿瘤细胞的活性 在体外试验研究纯化的β-防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的作用情况,发现β-防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞具有毒性作用,并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。对人淋巴细胞及实体瘤细胞的细胞毒性作用更为显著,尤其对抗 TNF的U9TR细胞、小鼠淋巴瘤YAC-1细胞和人组织细胞淋巴瘤U937细胞具有杀伤性[8,9]。

3.4 免疫活性 β-防御素不仅可以直接抵抗病原微生物,而且还具有免疫活性作用。HBD-2是肥大细胞的趋化因子,可引起肥大细胞活化和脱颗粒,致组胺和前列腺素释放,进一步使中性粒细胞在炎症部位移动和聚集[10]。这种趋化作用通过肥大细胞的高亲和力受体完成。同时,HBD-2不仅对幼稚树突状细胞有趋化作用,还对记忆型T细胞有趋化性。近来Yang等报道,小鼠β-防御素-2能刺激小鼠幼稚树突状细胞转化为成熟树突状细胞。β-防御素通过与趋化因子-6(CCR6)结合,趋化诱导幼稚树突状细胞和记忆T细胞聚集到炎症部位,介导共刺激分子(如B7家族成员)的表达上调和幼稚树突状细胞的成熟,进而活化 T淋巴细胞,触发体内强有力的特异性免疫应答[11]。此外,防御素还可以直接促进感染部位中性粒细胞的补充和积聚,也有研究表明β-防御素能够激活人的补体系统[12]。

4 β-防御素与呼吸道疾病的相关研究

4.1 β-防御素与上呼吸道疾病 目前已发现β-防御素广泛存在于鼻黏膜组织中,其功能的失活与病原微生物定植、集落于黏膜上皮而导致严重的感染关系密切,也可能参与鼻黏膜正常防御功能。β-防御素基因和蛋白质表达水平的上调与机体鼻黏膜系统发挥抗感染作用密切相关。Lee等[13]发现HBD-2 mRNA只在慢性鼻窦炎患者的下鼻甲黏膜和鼻息肉中检测到,且在鼻息肉中的水平明显高于鼻甲黏膜,这与参与鼻息肉形成的多种细胞因子,包括白细胞介素-3、白细胞介素-5、嗜酸性粒细胞诱导了HBD-2表达有关。β-防御素与咽喉部疾病的关系主要体现在慢性扁桃体炎中。腭扁桃体是咽黏膜相关淋巴组织的重要组成部分。王成硕等[14]应用逆转录聚合酶链反应的方法检测了慢性扁桃体炎组和正常对照组的扁桃体组织中HBD-1和HBD-2 mRNA的表达,实验结果表明:HBD-1在正常扁桃体和慢性扁桃体炎组织中均有表达,而HBD-2在单纯增生的扁桃体组织仅微弱表达,但在慢性扁桃体炎组织中表达明显升高。这表明HBD-1在扁桃体组织中为固有性表达,而HBD-2则为诱导性表达。以上结果与HBD在其他组织中的表达特点一致,说明扁桃体作为机体的“门卫”,是通过天然免疫和获得性免疫两种系统相互协调、相互补充来共同发挥作用的。此外,扁桃体上皮能够表达HBD这一事实,也提示耳鼻咽喉科医师应充分认识到扁桃体的天然免疫功能而慎行扁桃体切除手术。

4.2 β-防御素与下呼吸道疾病 肺囊性纤维化患者气道有各种菌(常见绿脓杆菌和金葡菌等)定植和慢性感染过程,但这种感染只局限于呼吸道,而不造成全身扩散,说明是呼吸道局部防御功能缺陷所致。肺囊性纤维化是常染色体隐形遗传性疾病,是由囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFT R)失去功能所致,CFTR是cAMP调节的氯通道。肺囊性纤维化的特点是气道中性粒细胞炎性反应,慢性细菌感染和气道阻塞。气道过度炎性反应是CFT R丧失功能所致还是继发于感染,在肺囊性纤维化患者的支气管肺泡灌(BALF)中能检测到HBD-1和HBD-2,HBD-2随着肺功能的恶化而下降。说明防御素活性的改变可能是CF患者容易感染的原因之一[15]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)与HBD-1的基因多态性的发生有关。吸烟者只有10%～20%会发生COPD,因此除了环境因素外,遗传因素参与COPD的发生。研究发现中国汉族人群中编码HBD-1的基因HDEFBl 668C/G多态性与COPD易感性有关,HBD-3表达于支气管和细支气管上皮细胞,细菌性肺炎患者急性期血浆HBD-3浓度升高,治疗结束后明显降低。说明HBD-2参与气道的抗微生物过程,并且可作气道炎症反应的有用标志物[16]。

5 展望

防御素不仅是新型高效的抗菌物质,而且作为机体本身的一种活性物质,相对不具有免疫原性,病原菌也不易对其产生耐药性,因此可以替代抗生素发挥广谱高效的抗菌作用。此外防御素能调节机体免疫应答和炎症反应,调节组织创伤修复。因此,可以诱导β-防御素的表达,来增强机体抗感染能力和免疫力。目前已有的诱导剂由于其毒性作用,难以直接作用于人体和用于今后的临床开发,是否存在安全有效的诱导剂便成为研究关注的焦点。

数千年来中药在防治疾病方面发挥了重要的作用,研究表明大多数具有良好抑菌作用的中药是通过全面提高机体免疫功能、增强机体抵抗力而达到抗菌目的。防御素的多种生物学活性给人们一个重要启示:中药有可能是通过诱导先天性免疫分子防御素的分泌发挥抗菌作用而启动机体有效的抗感染。如果中药确实能够增加内源性防御素的表达,那么在天然防御素获得困难的情况下,毫无疑问这一点对防御素开发成为抗生素也提供了新的思路。目前笔者研究团队开展了关于玉屏风散影响上呼吸道黏膜β-防御素mRNA表达情况的研究,进而探索玉屏风散对上呼吸道黏膜非特异性免疫分子的作用机制,促进中药诱导剂有效的研究及为中药的新药开发研究打下基础,并期望将祖国传统医药作为解决临床耐药菌的新治疗途径。

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