抗酒精化学损伤的茶氨酸复合配方筛选与体外抗氧化活性研究

李大伟 张士康 朱跃进 施海根

（中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016）

抗酒精化学损伤的茶氨酸复合配方筛选与体外抗氧化活性研究

李大伟 张士康*朱跃进 施海根

（中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016）

通过流动注射化学发光法筛选以茶氨酸为主要成分的强抗氧化性配方，研制以茶氨酸、γ-氨基丁酸等茶叶特征成分为主要配方的复合氨基酸颗粒剂（以下简称功能修饰因子）。采用不同溶解载体溶解不同浓度的功能修饰因子，通过对·OH、DPPH·、H2O2清除能力和过氧化脂质抑制作用的测定，研究功能修饰因子的抗氧化性能。结果表明，以水、42%乙醇、42%茶酒作为溶解载体溶解的功能修饰因子，均具有较好的抗氧化性能，其中功能修饰因子的42%茶酒溶液在较低浓度就显示出很好的清除效果，且浓度与清除能力呈现明显的量效关系，表明茶酒中以儿茶素为主体的茶叶功效成分与功能修饰因子具有较强的协同增效作用。当浓度为4g/mL、1g/mL、2.5g/mL、5g/mL 时， 对·OH、DPPH·、H2O2、 过氧化脂质的清除率最高， 分别为 61.8%、61.92%、51.05%、85.93%。

茶氨酸 茶特征成分 功能修饰因子 抗氧化活性 自由基

随着生物技术、营养学、医学和相关学科的发展，从天然产物中分离、提纯特定功能成分，并探索和验证其生理功能的研究发展很快，一大批具有明确生理功能的天然产物被广泛地用于食品行业，为功能食品、保健品和药品的开发和研究提供了重要的物质基础和前提。

近年来研究发现[1,2,3]，以儿茶素、茶氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）为主的茶叶特征成分在对抗酒精所致的自由基损伤方面有突出功效，儿茶素与茶氨酸以及数种功能氨基酸联合使用更可显著增强抗氧化作用，提示儿茶素与茶氨酸等其它氨基酸具有协同增效作用。其原因可能是茶多酚（TP）的某些组分与氨基酸之间的氢键缔合形成稳定的供氢体，它不仅提高了TP的抗氧化活性，而且还能与不饱和脂肪酸的氧化产物相结合。

本研究以酒精化学损伤的自由基理论为基础，以体外抗氧化性能评价为指标，从众多功能氨基酸中进行广泛筛选，开发研制以茶叶中氨基酸为主，其他功能氨基酸为辅的复合氨基酸颗粒剂（简称功能修饰因子），用以延缓及减轻饮酒所带来的机体损伤，亦可与各种酒类进行复配，对酒体进行功能强化。在配方筛选优化基础上，开展功能修饰因子对·OH、DPPH·、H2O2清除能力和过氧化脂质抑制作用的测定。评价了以不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子溶液的抗氧化能力，为从清除自由基途径开发预防和缓解酒精损伤新产品提供基础性数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-茶氨酸：自制，纯度≥99.8；γ-氨基丁酸(γ-GABA)等功能氨基酸：其中γ-氨基丁酸为自制，纯度≥85%，其他氨基酸均为生化试剂，购自上海博奥生物科技有限公司；茶酒：自制，酒精度42%vol、儿茶素含量250mg/100mL；无水乙醇、DPPH·（1,1-二苯基-2-苦肼基自由基）、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘已二胺、亚硝酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，均为分析纯，杭州华东医药股份有限公司。

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪：西安瑞迈分析仪器有限公司；UV-2102PC型紫外可见分光光度计：龙尼柯 （上海）仪器有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；pHS-3C酸度计：上海雷磁仪器厂；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHB-111A循环水式多用真空泵：上海豫康科技仪器设备有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器 （上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 功能修饰因子筛选实验设计

根据文献报道[4]及单因素试验，从众多功能氨基酸中选取对酒精化学损伤有保护作用的6种氨基酸，作为与茶氨酸复配的配方因子，采用7因素2水平进行正交实验设计，功能修饰因子筛选实验正交因素水平见表1，正交实验组合L8（27）见表2，通过流动注射化学发光法对抗氧化性强的配方组进行筛选。

1.2.2 功能修饰因子体外抗氧化活性的筛选

抗氧化活性的测定采用流动注射化学发光法[5]。用pH7.4、0.05mol/L的KH2PO4-NaOH缓冲溶液，配制2.0×10-4mol/L的鲁米诺溶液及6.0×10-2mol/L的Fe2+-EDTA溶液；并用去离子水配制浓度30%的双氧水溶液。吸取0.2mLFe2+-EDTA溶液与鲁米诺溶液，置25mL容量瓶中，用该缓冲溶液定容至刻度，混匀后作为载流流动相；同时将配制好的双氧水注入进样环，按运行程序进行流动注射化学发光分析，以600V，50Hz，扩增1倍信号值条件，进行20次/s自动归零数据采集。

按表1～2组方进行等浓度配比，精密称取各样品0.1g（精确到0.0001g），用去离子水定容至100mL，分别加入配制好的样品于流动相中，进行发光分析，并以如下公式计算发光抑制率(%)：

表1 正交实验因素与水平表（mg/mL）Table1 The orthogonal factors level（mg/mL）

表2 功能修饰因子筛选正交实验组合L8（27）（mg/mL）Table2 The results of orthogonal experimentsL8（27）of the Function modifier（mg/mL）

其中Fa为未加抗氧化物质的发光强度，Fb为加入抗氧化物质后的发光强度。

1.2.3 功能修饰因子配方对·OH清除率的测定[6]

采用Fenton反应法产生·OH，·OH可氧化水杨酸产生有色物质，该产物在510nm处有强吸收峰。当加入清除·OH的物质时，则会与水杨酸竞争·OH，减少有色物质生成，降低吸光度。实验操作如下：取若干支25mL的试管，按顺序加入9mmol/L FeSO4溶液 1mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL，不同质量浓度的功能修饰因子溶液2mL，8.8mmol/L H2O2溶液 2mL， 于 37℃下反应0.5h。以蒸馏水为空白，在510nm处测定样品的吸光度A1，按下式计算其清除率：

清除率(%)=[A0－（A1－A2）]/A0×100%

式中：A0为空白对照液的吸光度，以蒸馏水代替样品液的吸光度；A1为样品液的吸光度；A2为样品溶液本身的吸光度，以蒸馏水代替显色剂的吸光度。

1.2.4 功能修饰因子配方对DPPH·清除率测定[7]

DPPH·（1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)是一种稳定的人工合成的自由基，具有典型紫色，在517nm处有最大吸收，当它与提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成无色产物，紫色变浅。实验操作如下：取5×10-5mol/L的DPPH·溶液4mL，加入不同质量浓度的功能修饰因子0.20mL，摇匀后放置30min，测定517nm处的吸光度A1，按下式计算其清除率：

清除率(%)=[A0－（A1－A2）]/A0×100%

式中：A0为DPPH·溶液的吸光值；A1为样品组与DPPH·溶液混合后的吸光值；A2为样品组的吸光值。

1.2.5 功能修饰因子配方清除H2O2能力的测定[8]

用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制10mmol/L的H2O2溶液，取上述溶液5mL加入等体积不同质量浓度的功能修饰因子，混匀后在248nm处测定吸光度，按下式计算清除率：

清除率(%)=[A0－（A1－A2）]/A0×100%

式中：A0为不加样品液的H2O2吸光度，A1为加样品液的H2O2吸光度，A2为不加H2O2的样品溶液吸光度。

1.2.6 脂质过氧化抑制作用的测定

(1)卵磷脂体系试液的配制

卵磷脂溶液(LLS)：30mg卵磷脂溶解于30mL 10mmol/L pH7.4 PBS(磷酸缓冲液)，冰浴震荡。

TCA-TBA-HCl混合液：三氯醋酸(TCA)∶硫代巴比妥酸(TBA)∶盐酸=15g∶0.375g∶2.1mL，溶解于蒸馏水，定容至100mL。

(2)测定步骤

于样品试管中依次加入1.0mL卵磷脂溶液(LLS)、1.0mL 0.1%三氯化铁溶液 (FeCl3)、1.0mL 4 mmol/L抗坏血酸和0.2mL样品，混匀，避光，于37℃水浴30min，再加入2.0mL TCA-TBA-HCl混合液，90～100℃水浴15min，迅速冷却，以2000r/min转速离心10min，取上清液在532nm处测吸光值A，同上做空白对照，以维生素E为对照，每样品重复3次。

清除率(%)=[1－(A1－A2)/A0]×100%

式中：A1为加抗氧化剂时溶液的吸光度，A2为加抗氧化剂而未加TCA-TBA-HCl溶液的吸光度，A0为只加溶剂时溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 功能修饰因子筛选实验结果

在1.2.1实验基础上，得出茶氨酸和氨基酸Ⅰ、氨基酸Ⅱ、氨基酸Ⅴ、氨基酸Ⅵ配伍组成的功能修饰因子抗氧化性效果较好，见图1。

图1 功能修饰因子自由基清除能力Fig.1 Radical scavenging capacity of the Function modifier

由图1可以看出，相同浓度下，各配方组对自由基都有了较好的清除效果，显示各配方组均具备较好的抗氧化性能，自由基清除效果依次为3＞2＞5＞7＞6＞8＞4＞1，清除率依次为：72.06%、70.06%、67.71%、67.72%、67.6%、65.07%、60.06%、58.64%。故选用茶氨酸和氨基酸Ⅰ、氨基酸Ⅱ、氨基酸Ⅴ、氨基酸Ⅵ配伍作为功能修饰因子配方。

2.2 不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子体外抗氧化活性评价

2.2.1 功能修饰因子对·OH的清除效果

羟自由基是最活泼的活性氧自由基，反应速率极快，对机体危害很大。图2为不同溶解载体溶解不同浓度的功能修饰因子对·OH的清除效果。

图2 功能修饰因子对·OH的清除能力Fig.2·OH radical scavenging capacity of the Function modifier

由图2可知，不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子对·OH有一定的清除效果，其清除率的大小依次为：功能修饰因子42%茶酒溶液＞功能修饰因子42%乙醇溶液＞功能修饰因子水溶液。3种溶液对·OH的清除效果都随着用量的增加而增加，当用量为4g/mL时，功能修饰因子水溶液、功能修饰因子42%乙醇溶液、功能修饰因子42%茶酒溶液的清除率分别为51.96%、56.99%、61.8%，继续增加浓度，清除效果增加不明显。

2.2.2 功能修饰因子对DPPH·的清除效果

不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子对DPPH·清除效果，如图3所示。由图3可以看出，不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子对DPPH·有一定的清除效果，以功能修饰因子42%茶酒溶液效果最好，其次是功能修饰因子42%乙醇溶液、功能修饰因子水溶液。在0～1g/mL浓度范围内，3种提取液对DPPH·的清除效果都随着浓度增加而增加，当浓度为1g/mL时，功能修饰因子水溶液、功能修饰因子42%乙醇溶液、功能修饰因子42%茶酒溶液的清除率分别为42.68%、58.99%、61.92%，继续增加浓度，功能修饰因子42%乙醇溶液清除效果继续增加，而功能修饰因子水溶液和功能修饰因子42%茶酒溶液增加不明显。

图3 功能修饰因子对DPPH·清除能力Fig.3 DPPH·radical scavenging capacity of the Function modifier

2.2.3 功能修饰因子对H2O2的清除效果

H2O2可以与细胞内的Fe2+离子生成·OH，另外，紫外线也能使H2O2生成羟基自由基，导致各种疾病发生，加速机体衰老，给生物体带来危害。图4为不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子对H2O2的清除效果。

图4 功能修饰因子对H2O2的清除能力Fig.4 H2O2scavenging capacity of the Function modifier

由图4可知，不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子对H2O2的清除效果分别为：功能修饰因子42%茶酒溶液＞功能修饰因子42%乙醇溶液＞功能修饰因子水溶液。不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子对H2O2的清除效果都随着浓度的增加而增加，当样品浓度为2.5g/mL时，功能修饰因子42%茶酒溶液、功能修饰因子42%乙醇溶液、功能修饰因子水溶液对H2O2的清除率分别为51.05%、42.21%、22.66%。

2.2.4 对脂质过氧化的抑制作用

脂质过氧化是慢性酒精性肝病的病因之一，其终产物MDA可与膜蛋白、酶发生交联反应，使膜透性增加，导致细胞膜结构、功能和代谢发生变化，对人体危害极大，其测定结果见图5。

图5 功能修饰因子对脂质过氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition effects of the Function modifier on lipid peroxidation

由图5可见，在0.5g/mL～5g/mL的浓度范围内，不同溶解载体溶解的不同浓度的功能修饰因子均具有一定的抑制脂质过氧化的能力，且抑制脂质过氧化的能力随着浓度的增大而增强。三种溶解载体在高浓度均显示较好的清除过氧化脂质的能力，当浓度为5g/mL时，功能修饰因子水溶液、功能修饰因子42%乙醇溶液、功能修饰因子42%茶酒溶液对过氧化脂质的清除率分别为51.25%、72.13%、85.93%。

3 结论

采用自由基体系、过氧化氢体系、脂质过氧化体系研究功能修饰因子的抗氧化活性，结果表明，水、42%乙醇、42%茶酒溶解的功能修饰因子，均具有较好的抗氧化性能，其中功能修饰因子42%茶酒溶液在较低浓度就显示出很好的清除效果，且浓度与清除能力呈现明显的量效关系，表明茶酒中以儿茶素为主体的茶叶功效成分与功能修饰因子具有较强的协同增效作用。当浓度为4、1、2.5、5g/mL 时，对·OH、DPPH·、H2O2、过氧化脂质的清除率最高分别为 61.8%、61.92%、51.05%、85.93%。

在慢性酒精性肝病和其他各种形式的中毒性肝病中，有毒物质在肝内代谢产生的自由基具有重要的致病作用。过量的自由基可以与细胞膜脂质、脂蛋白共价结合，生成过氧化脂质等毒性物质，最终导致细胞被破坏。本研究筛选的茶氨酸复合配方经体外实验显示了其优良的清除自由基能力，这提示其在治疗酒精及其他中毒性肝损伤方面可能具有相当的开发潜力，有关该配方的体内作用效果有待进一步深入研究。

[1]张宇,陈韶华,张幸国,等.茶多酚治疗慢性酒精性肝损伤的实验研究[J].中华肝脏病杂志,2005,(4):125-127.

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[3]堀江典子,菅美奈子,等.GABA(γ-氨基丁酸)的功能性[J].中国食品添加剂,2010,(6):169-173.

[4]刘志皋.食品营养学[M].北京:中国轻工业出版社,2003.

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[8]郭丽萍,卢家炯,仇宏伟.香蕉皮多酚清除自由基作用的初步研究[J].食品科技,2007,(6):131-134.

Screening of Theanine Complex for Inhibition of Alcohol Chemical Injury and its In Vitro Antioxidant Activity

LI Da-wei,ZHANG Shi-kang*,ZHU Yue-jin,SHI Hai-gen
(Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China)

Flow-injection chemiluminescence was used to determine the antioxidant activity of product mainly composed of theanine.Complex was prepared by theanine and γ-amino butyrate as main antioxidants(Hereinafter referred to as functional modifier).The antioxidant activities,including the ·OH radical,DPPH·radical,H2O2scavenging activities and inhibition of Lipid peroxide,of the complex solutions with differed amount in different solvents were determined.The results showed that water,42%ethanol,42%tea wine as a function of solvent modifier,has better oxidation resistance,in which the function modifier solution in the lower 42% of tea wine shows good concentration on the removal of effect,and the concentration and scavenging obviously showed dose-response relationship,indicating that the catechins in tea and wine as the main effect of composition and function of the tea has a strong modifying factor synergies.When the concentrations were 4 g/mL,1g/mL,2.5g/mL,5g/mL,the·OH,DPPH·,H2O2,lipid peroxidation highest clearance rates were 61.8%,61.92%,51.05%,85.93%.

Theanine,Characteristic antioxidant ingredients in tea,Antioxidant activity,Function modifier,Radical

2011-05-17

部级科技成果：供销鉴字[2010]第08号

李大伟（1983-），男，吉林长春人，研究实习员，主要从事功能性食品的研究开发工作。

*通讯作者：zsk6510@163.com