基于SPSS空列正交设计的茶黄素动态提制工艺快速优化

孔俊豪 杨秀芳 涂云飞 孙庆磊 陈小强

（中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016）

基于SPSS空列正交设计的茶黄素动态提制工艺快速优化

孔俊豪 杨秀芳﹡涂云飞 孙庆磊 陈小强

（中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016）

以茶多酚为原料，采用动态-双相萃取法制备茶黄素。运用SPSS软件，以反应时间、多酚氧化酶浓度、水酯两相比为过程调控因素进行有空白列正交试验设计，对反应条件进行了优化分析，优化后的反应条件为：酶浓度1600U/g，水酯两相比1:0.5，反应时长60min，该反应条件下茶黄素的合成均量为846mg，粗品茶黄素组分含量为47%。

空列正交试验 茶黄素 动态 优化

茶黄素是红茶加工过程中经儿茶素类氧化聚合形成的具有苯骈卓酚酮结构的高活性二聚体，含量一般在0.5%到2%之间，其含量高低与红茶品质呈正相关。近年来其确切的生物学活性及药理作用已被众多试验研究所证实[1-3]，越来越多地应用于保健食品、添加剂、临床医药、高端日化领域，旺盛的市场需求使得茶黄素的离体转化技术成为学界研究的热点之一。

报道的茶黄素制备方法有化学氧化法、固定化酶膜法、双液相氧化法[4-8]，尚未见有分批补料—动态萃取的反应方式用于实验。本研究根据前期预试验及模式比较，选取了反应时间、酶浓度、水酯两相比作为主要因素，以减量处理实现动态输入的过程控制，通过SPSS空列设计，将复杂问题简单化，通过少量试验获得可信度高的有用信息，从而快速、高效得到优化的反应工艺参数，为规模化制备技术的实际应用提供有效的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：90%茶多酚（儿茶素含量46%，浙江东方茶叶科技有限公司购买）；鲜叶（龙井43，杭州翠峰茶叶基地提供）。

试剂：乙酸乙酯，AR，杭州双林化工试剂厂；柠檬酸，AR，如皋市金陵试剂厂；磷酸氢二钠，AR，湖州湖试化学试剂有限公司；甲醇，AR，衢州巨化试剂有限公司；聚乙烯聚吡咯烷酮，AR，上海伯奥生物科技有限公司；石英砂，AR，国药集团化学试剂有限公司；EDTA，AR，天津华特化研科技有限公司；乙腈，HPLC级，天津市康科德科技有限公司；乙酸，AR，湖州湖试化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JPR-2双层玻璃反应釜，杭州欧尔柏维科技有限公司；DHJF-4005低温恒温反应槽，杭州惠创仪器设备有限公司；HL-2D数显恒流泵，上海沪西分析仪器厂；MJ-250BP02A植物组织捣碎机，广州美的生活电器制造有限公司；3K15低温冷冻离心机，德国SIGMA公司；MDF-U338低温冰箱，大连三洋冷链有限公司；UV-2102 PC型分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；H.H.S.11-2K电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂。

1.3 试验方法

1.3.1 PPO酶液提取及活性测定

PPO粗酶液提取：准确称取茶鲜叶25g于植物捣碎机中，加入pH4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液125mL、石英砂10g、聚乙烯聚吡咯烷酮1.5g，匀浆提取粗酶液，过滤，转速1000r/min离心15min，取上清液，置4℃冰箱备用。

酶活测定方法[9]：取酶上清液1mL，加3mL反应混合液（0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液：0.1%脯氨酸：1%邻苯二酚=2:0.4:0.6），于30℃恒温水浴反应10min，平行测定三次。酶活性以单位体积酶液每分钟OD460增加0.001为一活性单位（U）。

1.3.2 茶黄素浓度测定

准确移取茶黄素反应釜中酯相层溶液5mL，0.45μm膜过滤，70%甲醇定容至 50mL，进样10μg， 以 HPLC 方法（ISO14520-2）进行 组分 检测[10]。流动相A：分别将90mL乙腈，20mL乙酸，2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm膜。流动相B：分别将800mL乙腈，20mL乙酸，2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm膜。色谱条件如下：

流动相流速：1mL/min，柱温：35℃，紫外检测器：λ=278nm

梯度条件：100%A相保持10min→15min内由100%A相→68%A相、32%B相保持10min→100%A相

1.3.3 茶黄素动态双相酶促制备工艺

用pH4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液为水相溶剂，配制茶多酚底物溶液，待用。在双层玻璃反应器内加入乙酸乙酯相，然后将1.3.1中的酶清液加入，通入氧气（12Mpa，0.5L/min），数显恒流泵速度40r/min，反应器搅拌转速 360r/min，进行反应，反应结束收集反应液，低温冷冻离心机1000r/min离心20min，收集酯相溶液，记录准确体积，转相，冷冻干燥可得茶黄素产品。

1.3.3 SPSS空列设计的L9(34)正交实验

试验反应体系条件下，考虑酯相体积和酯相浓度组别之间的差异性，以茶黄素生成量(Y)为工艺考查指标，以反应时间(A)、酶浓度(B)、水酯两相比(C)为考查变量，设置空列误差项（D），进行四因素三水平L9(34)空列正交试验设计，结合统计分析和参数显著性评判，以快速确定动态反应提制茶黄素的最佳工艺参数，试验因素表如表1所示。

表1 茶黄素提制优化因素水平表Table1 Between-subjects factors for preparation of theaflavins

直接运用SPSS16.0软件进行有空列正交设计，所有试验均进行三次重复，试验结果经计算处理，取均值后输入SPSS16.0运行分析[11-12]。

2 结果与分析

依据正交试验组的计算结果，进行极差分析和方差分析。

表2 茶黄素动态提制试验结果直观分析Table2 Range analysis of experiment results for preparation of theaflavins

2.1 极差分析

从直观分析表2中各因素的极差项R可以看出，试验因素组别范围内，各因素对产物茶黄素合成量及收率影响程度的顺序为：A＞B＞C，即反应时间是最主要的影响因素，酶浓度和水酯两相比是影响相对较次要的因素。根据各因素水平对应的平均值k可以推断，采用方案A3B3C1可获得较高的产物量。

在正交表的处理过程中，各因素间交互作用的存在可从空白列（误差项）中反映出来。本试验条件范围内，主因素之外的第四列（误差列）极差最小，因而可以初步判定不存在显著的交互作用以及未考虑到的其它重要因素。

2.2 方差分析

极差分析的局限性在于不能估计试验过程及试验结果测定中必然存在的误差，因而不能区分某因素各水平间所对应的试验结果，其差异性的来源。采用SPSS软件进行单变量方差分析，以期把因素水平的变化所引起的试验结果间的差异与误差的波动所引起的试验结果间的差异区分开，并给出可靠的数量估计。方差分析结果见表3。

表3 单变量多因素方差分析Table3 Tests of between-subjects effects

方差分析表（表3）对三个因素（不含空列项）作出了方差分析，可以看出，A的显著值为0.019，B的显著值为0.049，在α=0.05水平上均具有显著意义 （P＜0.05），而C因素不具有显著性意义（P=0.063＞0.05），由F值的量值比较也可看出。因此试验反应体系下反应时间和酶浓度同为影响反应的主要因素，反应时间对于茶黄素累积量的显著性高于酶浓度，水酯两相对试验结果的影响较小。

由表4单因素统计量表分析可知，A选水平3、B选水平3，C的显著值为0.063，无显著意义(P＞0.05)，水平 1、2、3 均可，但从节省能源考虑，以1水平为宜。

表4 单因素统计量表Table4 Estimated marginal means

综上方差分析可知，酶催化合成茶黄素的最佳工艺水平为A3B3C1，与极差分析结果高度吻合。

图1 酯相层产物的HPLC图Fig.1 HPLC spectra of product in ethyl acetate phase

图2 反应产物粗品茶黄素的HPLC图Fig.2 HPLC spectra of crude theaflavins

2.3 验证性试验

为了验证优选工艺条件的可靠性和重现性，按照动态反应过程控制条件：酶浓度1600U/g，水酯两相比1:0.5，反应时长60min开展重复试验进行验证。收集酯相层溶液 （10倍稀释样品HPLC图谱见图1），试验平行3次，取均值，计算转化后茶黄素的合成量为846mg，证明预测条件下的试验结果比原先正交试验组合方案要高，说明工艺条件预测的可靠性较好。经过滤转相，冷冻干燥得到茶黄素样品经分析其纯度为47%（HPLC图谱见图2），优于静态双液相酶促氧化法。

3 结论

将动态酶促反应模式引入茶黄素的双相合成研究，基于产物茶黄素合成量的最大化，采用空列正交试验设计对试验的主要因素进行显著性分析，极差分析和方差分析共同表明，反应时间和酶浓度是影响反应产物合成量的显著性因子，而水酯两相比对反应结果的影响相对较小。获得的最佳工艺条件是：酶浓度1600U/g，水酯两相比1:0.5，反应时长60min，经验证结果高于正交试验组中的产物合量。由此可见，通过SPSS空列正交试验及正交分析，所得出的优化工艺条件是可靠的，为生产工艺的技术改进提供了试验技术基础。

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Fast Optimization of Dynamic Preparation of Theaflavins through Blank Column-Orthogonal Design by SPSS

KONG Jun-hao,YANG Xiu-fang﹡,TU Yun-fei,SUN Qing-lei,CHEN Xiao-qiang
(Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China)

The preparation technology oftheaflavins with dynamic two-phase system using tea polyphenols as raw material was introduced.The reaction conditions were optimized with blank column orthogonal experiment design by SPSS.The reaction factors such as polyphenol oxidase(PPO)concentration,the ratio of water/ethyl acetate and reaction time were studied.It was indicated that the optimum reaction conditions were as follows.PPO concentration was 1600U/g,the ratio of water/ethyl acetate was 1:0.5,reaction time was for 60min,846 mg of theaflavins were synthesized at the optimum extraction conditions,accordingly,the content of crude product reached 47%.

Blank column-orthogonal,Theaflavins,Dynamic,Optimization

2011-04-26

孔俊豪（1982-），男，河南漯河人，研究实习员，主要从事茶叶生物活性物质的提纯及衍生产品开发。

﹡通讯作者：teatesting@sina.com