肝纤维化形成过程中大鼠血清中胰岛素样生长因子结合蛋白－2的动态变化

申凤俊，赵彩霞， 唐 瑾 (山西医科大学第一临床医学院消化科，太原 030001;通讯作者，E-mail:919016603@qq.com)

肝纤维化是各种慢性肝病发展到终末期的必经阶段，正常时肝的纤维组织形成和降解保持平衡，如果形成增多而降解减少则可导致肝纤维化。许多细胞因子通过复杂的信号转导途径在肝纤维化的形成中发挥着重要的作用［1］。胰岛素样生长结合蛋白－2(insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2)属于胰岛素样生长因子家族，可通过胰岛素样生长因子(IGF)依赖性和非IGF依赖性作用发挥其生物学功能，与肝纤维化的形成发展关系密切［2］。本实验采用CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型作为研究对象，探讨血清IGFBP-2在大鼠肝纤维化形成过程中的动态变化，并进一步明确血清IGFBP-2与肝纤维化的关系。

1 资料与方法

1.1 实验材料 雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g，由山西医科大学动物室提供，四氯化碳(CCl4)购自天津市风船化学试剂科技有限公司。IGFBP-2酶联免疫分析试剂盒产自上海西唐生物有限科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CCl4肝纤维化大鼠模型制备及动物分组

将36只大鼠随机分为2组:正常对照组6只，模型组30只。除正常对照组外，给予大鼠40%CCl4皮下注射，每周2次，共计8周。首次皮下注射剂量为5 ml/kg，以后为2 ml/kg。每周称重1次，根据体重调整CCl4用量。正常对照组给予相同剂量的油剂皮下注射，并于8周末将正常对照组大鼠6只全部处死，留取血及肝组织，同时测定下述各指标。各组大鼠试验期间均予饮用水及普通饲料喂养。模型组在开始注射CCl4后的第2、4、6、8周末在同等条件下分别处死大鼠6只，留取血及肝组织标本，同时测定下述各指标。

1.2.2 常规病理检查 肝组织用10%中性福尔马林液固定，并进行常规HE与Masson三色染色，光镜下观察肝组织标本。应用Leica Q500IW图像分析系统(德国)对Masson三色染色的肝组织进行图像处理。在10×10倍光镜下，摄取图像，测定标准光栏中胶原(绿色)的面积，每张切片随机选取3个视野，每个视野以汇管区为中心，计算胶原的面积比(面积比=胶原面积/视野中肝脏面积×100%)。

1.2.3 血清肝功测定 ALT水平应用全自动生化分析仪测定，由专人操作。

1.2.4 门静脉压力测定 山西医科大学生理实验室提供的BL410生物机能实验系统测定，由专人操作。腹腔注射麻醉后，打开腹腔暴露门静脉主干，于肠系膜前静脉右侧靠近门静脉处分离出一回肠肠系膜静脉分支，结扎其远端，然后用血管剪剪开一适宜缺口，将PE100导管自缺口插入后，沿肠系膜前静脉上行，通过脾静脉至门静脉主干，固定导管并接通压力换能器测量门静脉压力。

1.2.5 IGFBP-2检测 采用酶联免疫试剂盒测定，用双抗体夹心ABC-ELISA法。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，所有数据以±s表示，组间比较采用ANOVA单因素方差分析，相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 组织病理改变 根据病理切片的HE染色与Masson三色染色结果(见图1)，正常对照组肝脏肝小叶结构正常，肝细胞索排列规则有序;模型组随造模时间的延长，肝纤维化程度逐渐加重，肝细胞水肿加重，出现气球样变，部分肝细胞出现轻度脂肪变;汇管区及周围炎症范围扩大，可见不同程度碎屑坏死，炎细胞形成桥样连接，中央静脉周围及汇管区胶原纤维与网状纤维沉积增多并向外延伸，形成纤维间隔，至8周末，正常肝小叶结构消失，大量纤维包绕增生的肝组织形成假小叶，甚至部分到达早期肝硬化阶段。

图1 各组肝组织病理变化(Masson三色染色，×100)Fig 1 Pathological changes in normal rats and liver fibrosis rats(Masson staining，×100)

应用计算机图像分析系统显示，模型组2周肝脏总胶原沉积与正常对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。模型组4周肝脏总胶原沉积较正常对照组明显增加(P＜0.01)。随着造模时间的延长，模型组肝脏总胶原沉积增加更明显，显著高于正常对照组(P＜0.01，见表1)。

表1大鼠各时间肝组织胶原纤维面积百分比、ALT、门静脉压、血清IGFBP-2的动态变化(±s)Tab 1 The dynamic changes of the collagen fiber area percentage，ALT，portal vein pressure，IGFBP-2 in fibrotic rat liver(±s)

表1大鼠各时间肝组织胶原纤维面积百分比、ALT、门静脉压、血清IGFBP-2的动态变化(±s)Tab 1 The dynamic changes of the collagen fiber area percentage，ALT，portal vein pressure，IGFBP-2 in fibrotic rat liver(±s)

与正常对照组的比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n 肝脏胶原面积百分比 ALT/(U/L) 门静脉压/mmHg IGFBP-2水平/(μg/L)正常对照组 6 0.018 ±0.014 25.20 ±6.42 4.65 ±0.55 12.64 ±1.93模型组 2 周 6 0.024 ±0.016 23.80 ±4.97 8.43 ±0.86* 15.87 ±1.17＊＊4 周 6 0.210 ±0.031＊＊ 51.60 ±8.26* 12.26 ±1.31* 21.07 ±1.47＊＊6 周 6 0.310 ±0.037＊＊ 109.80 ±33.66＊＊ 15.03 ±2.29＊＊ 30.06 ±2.37＊＊8 周 6 0.390 ±0.036＊＊ 139.80 ±38.88＊＊ 16.22 ±2.08＊＊ 40.72 ±1.28＊＊

2.2 大鼠肝功能的变化 从表1可看出，模型组大鼠4周肝功能ALT水平较正常对照组高(P＜0.05)，随着动物实验的进行及肝纤维化的形成和发展，ALT水平逐渐增加，显著高于正常对照组(P＜0.01)。

2.3 大鼠门静脉压的变化 模型组大鼠2周门静脉压水平就较正常对照组高(P＜0.05)，而且随着动物实验的进行及肝纤维化的形成和发展，门静脉压水平逐渐增高，显著高于正常对照组(P＜0.01，见表1)。

2.4 大鼠血清中IGFBP-2的变化 由表1可知，模型组大鼠第2、4、6、8周IGFBP-2水平较正常对照组明显增加(P＜0.01)。且随着肝纤维化的进展，血清IGFBP-2水平逐渐增高。

2.5 模型组大鼠血清IGFBP-2水平与肝纤维化程度相关性分析 肝纤维化的程度可以用肝脏胶原面积比定量表示，将模型组大鼠肝脏胶原面积比与模型组血清 IGFBP-2进行相关性分析，得出r=0.874 2，表明肝纤维化程度与血清IGFBP-2水平呈正相关(P＜0.001)。

3 讨论

肝星状细胞是胶原纤维的主要来源，是肝纤维化形成的重要因素。激活的肝星状细胞通过自分泌和旁分泌产生多种细胞因子，在肝纤维化的发生中起重要作用，这些细胞因子包括转化生长因子、血小板衍生因子及胰岛素样生长因子等［3］。血液中的IGFBP-2主要由肝组织产生释放［4］，它是对胰岛素样生长因子(IGF)的活性起调节作用的重要蛋白，IGF在血液和组织液中不是游离存在而是与IGFBP高亲和以复合物的形式存在，血清IGFBP-2通过对IGFs作用的调节而在肝纤维化的形成中发挥重要作用。因此，本实验通过建立CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，测定血清IGFBP-2的动态变化，明确血清IGFBP-2与肝纤维化的关系。

本实验结果显示，模型组大鼠随着肝纤维化程度的加重，门静脉压力增高，IGFBP-2水平增高。进一步对血清IGFBP-2水平与肝纤维化程度进行相关性分析，结果显示血清IGFBP-2水平与肝纤维化程度呈正相关(P＜0.01)，与文献报道相一致［5，6］。体外培养肝细胞受损时，肝细胞IGFBP-2的表达和分泌显著增强。推测IGFBP-2参与了肝细胞的损伤过程［7］。枯否细胞与肝细胞共同培养可以诱导肝细胞合成IGFBP-2增多［8］。激活的星状细胞可表达和分泌IGFBP-2。TGF-β1可刺激星状细胞表达和产生IGFBP-2，TGF-β1与肝纤维化关系密切，因此IGFBP-2参与了肝纤维化的发展［9］。

综上所述，随着肝纤维化程度的加重，门脉压力增高，血清IGFBP-2逐渐增加，IGFBP-2在肝纤维化的发生和发展中起重要作用。

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