纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合骨结合VEGF修复骨缺损的实验研究

顾晓东，梁庆威

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳110001）

如何理想的修复骨缺损一直是骨科领域的难题和研究热点。自体骨及异体骨移植都存在难以克服的缺点。组织工程技术的发展为解决这一难题提供了新的思路和方法。目前，支架材料和成骨活性因子联用修复骨缺损也成为组织工程中的一个研究热点。纳米羟基磷灰石/胶原复合骨模仿天然骨的成分及结构特征，具有良好的生物相容性、优异的骨传导性，可为细胞提供与天然骨相类似的微环境，这有助于骨系细胞的黏附、增殖及功能发挥［1～4］。血管内皮生长因子能促进人工骨的早期血管化和成骨，本实验联合应用纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合骨（nanohydroxyapatite/collagen，NHAC）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 修复大鼠桡骨缺损，采用10 ng、100 ng、300 ng的剂量梯度复合NHAC修复骨缺损，初步探讨不同剂量VEGF修复骨缺损效果的差异以及VEGF用于骨缺损修复的适宜剂量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：雄性Wistar大鼠30只，体质量180～220 g，购自中国医科大学实验动物部。

1.1.2 试剂：纳米羟基磷灰石粉末购自南京埃普瑞纳米材料有限公司，胶原蛋白粉末购自湖州珍露生物制品有限公司。VEGF购自沈阳博尔美公司，由美国PeproTech公司生产。CD31抗体，购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制备NHAC以及含有不同剂量VEGF的人工骨，人工骨制成后环氧乙烷消毒，无菌袋封存备用［5］。

1.2.2 动物分组、骨缺损模型的制备及材料植入：30只Wistar大鼠随机数字表法分为5组：空白组、单纯 NHAC 植 入 组 、NHAC/10 ngVEGF、NHAC/100 ngVEGF、NHAC/300 ngVEGF，每组 6只（12侧桡骨），其中前两组为对照组，后3组为实验组。制备大鼠桡骨中段5 mm骨缺损模型，依据分组情况分别植入相应材料，空白组不植入任何材料，关闭切口，不做内外固定。术后肌注青霉素8万U，连续3 d。

1.2.3 大体观察：术后观察动物饮食、日常活动能力及术后伤口愈合情况。

1.2.4 组织学检查：术后2、4、8周各组随机选取2只动物处死，截取桡骨缺损区骨段，常规制作石蜡标本。每个标本做厚度为5 μm的纵向切片，行苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察骨形成及塑型情况，并采用Lane-Sandhu法组织学评分标准评分。

1.2.5 免疫组织化学血管染色及血管计数：石蜡切片脱蜡水化后，一抗采用CD31抗体，常规ABC法行免疫组织化学染色。阳性染色表现为棕黄色或棕褐色颗粒着色于血管内皮细胞胞质，每张切片随机选取3个100倍视野计数，取平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

术后各组大鼠活动及进食可，双前肢肿胀，约1周左右肿胀消退，2周左右切口愈合，无感染化脓等不良反应，实验过程中无大鼠死亡。

2.2 苏木精-伊红（HE）染色

术后2周：空白组骨断端为纤维结缔组织，NHAC组及各实验组有较多炎性细胞浸润，有新生的岛状骨组织，各实验组软骨细胞生成较NHAC组多，其中NHAC/300 ngVEGF组的量在各实验组最多。4周：各组骨缺损断端均可见软骨成骨过程，并可见大量的成骨细胞，其中NHAC/300 ngVEGF组软骨细胞量最高，NHAC组、各实验组的人工骨材料少量降解，部分区域有规则排列的骨小梁生成，骨小梁周围可见类骨组织。术后8周：实验组的人工骨材料大部分已经降解，新生骨组织的形成量实验组明显高于NHAC组和空白组，其中NHAC/300 ngVEGF组的新骨形成量在各实验组中最多。实验组中可见大量成熟的板层状骨组织，有规则的骨小梁形成，NHAC组新生骨的改建较各实验组少。空白组增生不活跃。见图1。

2.3 Lane-Sandhu法组织学评分

除2周时NHAC组和NHAC/10 ngVEGF组织学评分差异无统计学意义外，各时间点血管内皮生长因子/纳米羟基磷灰石组组织学评分均高于纳米羟基磷灰石组及空白组，其中以NHAC/300 ngVEGF组的评分在各组中最高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.4 免疫组织化学血管计数

复合VEGF人工骨组在早期（2周）即有大量的血管生成，明显多于NHAC组（P<0.05）；随着人工骨的降解，新生血管逐渐增多，因此在4周内各组血管逐渐增多（P<0.05）；而随着新生骨的改造，不成熟的毛细血管逐渐被少数主要血管取代，血管数量减少，所以复合VEGF人工骨组在第8周时血管数量减少。其中NHAC/300 ng VEGF组血管数量在各实验组各时间点最多。见表2。

3 讨论

骨的血供十分丰富，血管生成对骨修复至关重要，新生血管不仅是氧气、营养物质和生长因子的运输通道，而且可为骨修复提供所需的间充质细胞及成骨细胞。缺乏良好的血供将导致骨愈合不良［6］。许多研究表明，在骨折愈合过程中，血管的生成要先于新骨形成［7，8］。血管内皮生长因子不仅能诱导血管内皮细胞生长、增殖，抑制血管内皮细胞凋亡，诱导血管平滑肌细胞迁移，促进血管生成［9］。而且，VEGF能促进成骨细胞分化、迁移、扩增［10］。

局部单纯应用VEGF因缺乏可吸附的支撑物而被迅速降解或随体液扩散，从而不能均匀持久地分布在骨缺损部位，不但不能保证局部作用的发挥，而且还会产生异位成骨或血管瘤等并发症。本实验采用的NHAC是生长因子的良好载体，可以对附着的VEGF提供缓释作用，从而使VEGF进入体内后不会快速扩散和分解。

本实验免疫组织化学染色表明，各实验组在2周时血管生长旺盛，为快速血管化阶段，在4周时，血管数量达到高峰。随着骨组织的成熟和改建，不成熟的毛细血管逐渐被少数主要血管取代，血管数量减少，在8周时，各实验组血管数量下降。在各时间段，NHAC/300 ngVEGF组的血管数量最多，与其它各组相比，差异有统计学意义。而空白组和NHAC组的血管数量在8周时最多。这表明VEGF能促进人工骨的早期血管化过程，并且随着VEGF剂量的增加，血管的生成也增加。组织学表明各实验组对骨缺损的修复效果要优于单纯应用NHAC，且随着VEGF剂量的增加，骨缺损的修复效果增加。组织学评分以NHAC/300 ng VEGF组最高，和其它组相比差异有统计学意义。本实验表明，复合了血管内皮生长因子的NHAC比单纯的纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合骨的骨修复能力更强。另外，血管化程度与新骨形成的数量呈正相关。正是由于血管的大量长入，使人工骨再血管化，从而为骨修复提供所需的间充质细胞及成骨细胞，进而促进新生骨组织的形成。

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