普罗布考对肾小球硬化大鼠肾组织转化生长因子β1的影响

苏雪松，周光宇，杜丰，李德天

（中国医科大学附属盛京医院肾内科，沈阳110004）

肾小球硬化是多种肾脏疾病发展的最终结局，是导致终末期肾病的重要原因，有数据显示我国终末期肾病的发病率呈上升趋势，因此抗肾小球硬化的有效治疗受到越来越广泛的关注。肾小球硬化的形成与发展是多因素参与、十分复杂且渐进的过程，它重要的病理特征是肾小球系膜细胞的过度增殖、进行性的细胞外基质沉积、相关细胞因子的作用等，其中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是调节肾脏炎症、硬化的最重要的生长因子之一［1］。本研究观察了普罗布考对阿霉素致肾小球硬化大鼠肾组织TGF-β1的影响，探讨其对肾小球硬化动物模型肾脏保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

雄性Wistar大鼠32只，8～10周龄，体质量200～250 g，由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供。盐酸阿霉素，购自深圳万乐药业有限公司；普罗布考（商品名之乐），购自齐鲁制药有限公司；TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗体、免疫组化染色试剂盒（即用型SABC）、DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司；其余普通试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立、分组及给药方法：所有大鼠随机分为3组：对照组（n=8）、模型组（n=12）和普罗布考治疗组（n=12）。模型组和治疗组大鼠麻醉后行左肾切除术，于术后第7天按5 mg/kg经尾静脉注射阿霉素，术后第28天按3 mg/kg再次经尾静脉注射阿霉素。对照组行假手术，术后同期注射等量生理盐水。治疗组大鼠于第1次尾静脉注射阿霉素后给予普罗布考500 mg·kg-1·d-1灌胃治疗，共12周。模型组与对照组予等量生理盐水灌胃。实验过程中，模型组大鼠死亡4只，治疗组大鼠死亡2只。

1.2.2 尿蛋白及血生化检查：于第0、4、8和12周末时用代谢笼准确收集24 h尿，尿蛋白测定采用柳氮磺酸比浊法。心脏采血，采用日立7170A自动生化分析仪测定血清肌酐、血尿素氮和血清白蛋白。

1.2.3 肾组织病理学检查：肾脏标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚3 μm，行常规苏木精—伊红（HE）和过碘酸—雪夫（PAS）染色后镜检。计算肾小球硬化指数（glomerulosclerosis index，GSI）：采用半定量的 RAIJ法［2］按如下公式计算：GSI=［（1×n1）+（2×n2）+（3×n3）+（4×n4）］/每张切片肾小球总数×100。

1.2.4 免疫组织化学检查：采用SABC法检测肾组织中的TGF-β1的表达，按试剂盒说明进行操作。以PBS代替一抗作为阴性对照，片中出现棕黄色颗粒为阳性结果。采用Floege半定量法［3］计分：0分，系膜基质染色弱或缺乏；1分，不超过25%的系膜区局部染色加深；2分，26%～50%的系膜区局部染色加深；3分，51%～75%的系膜区局部染色加深；4分，75%以上系膜区染色加深，每张切片计数20个肾小球积分，取均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠尿蛋白排泄量的变化

模型组和治疗组尿蛋白排泄量增加，在第4、8、12周时与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），治疗组尿蛋白排泄量在各观察时点均较模型组明显减少（P<0.05），见表1。

2.2 各组大鼠血清肌酐、血尿素氮及血清白蛋白水平的比较

模型组与对照组相比，血清肌酐、尿素氮均升高，而血清白蛋白显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗组与模型组比较，血白蛋白升高，血清肌酐、尿素氮下降（P<0.05），提示肾功能得到改善，但仍重于对照组（P<0.05），见表1。

2.3 肾组织普通病理

光镜下对照组无明显病理改变；模型组肾小球系膜基质中度至重度增生并呈弥漫性分布，呈现肾小球节段性硬化，小部分肾小球呈球形硬化，可见球囊粘连，囊壁中度增厚，毛细血管襻部分闭塞，部分代偿性扩张，间质纤维化，有炎性细胞浸润，小管灶性扩张，蛋白管型多见；治疗组上述病理改变明显减轻（图1）。模型组、治疗组及对照组的GSI分别为139.56±31.23，81.78±24.73 和18.01±6.12，表明治疗组肾小球硬化程度比模型组明显减轻，差异有统计学意义（P<0.05），但仍重于对照组（P<0.05）。

2.4 肾小球TGF-β1的表达

对照组大鼠TGF-β1在肾小球表达极少甚至不表达；模型组和治疗组的肾小球TGF-β1表达均明显增强（图2）。模型组、治疗组和对照组的Floege评分分别为3.18±0.47，2.54±0.61 和1.62±0.24。半定量分析结果显示，与对照组比较，模型组和治疗组TGF-β1的表达明显增高（P<0.05），而治疗组 TGF-β1的表达比模型组明显减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

本实验采用单侧肾切除加重复注射阿霉素的方法建立肾小球硬化大鼠模型，该方法肾小球硬化率较高，重复性和稳定性好，目前被认为是研究慢性肾功能不全比较成熟的动物模型［4］。实验结果证实，造模大鼠表现为大量蛋白尿、低白蛋白血症和肾功能恶化，且肾脏组织学改变为肾小球系膜细胞和基质增生、肾小球节段性硬化、间质纤维化、蛋白管型多见，说明复制阿霉素肾硬化模型是成功的。

肾纤维化是绝大多数肾小球疾病进展至后期的一种共同的组织学改变，TGF-β1在肾纤维化中的作用涉及到细胞外基质、细胞增殖及转分化、炎性浸润等各个环节，是介导肾小球硬化和肾间质纤维化的关键细胞因子。普罗布考具有调脂、抗氧化、稳定动脉粥样硬化斑块、改善内皮功能等作用，是目前有效的抗动脉粥样硬化药物之一，而且其在防治糖尿病及其并发症、改善肝功能等方面的作用日渐凸现［5，6］。最近的研究还发现，它在内膜细胞和大鼠系膜细胞具有抗增殖作用［7，8］。已有研究表明，普罗布考能够通过抑制JAK2/STAT途径的活化，减低TGF-β1和结缔组织生长因子等细胞因子的表达，从而减少高糖诱导的人肾小球系膜细胞细胞外基质积聚［9］。本研究结果显示，在阿霉素致肾小球硬化大鼠模型中，TGF-β1的表达明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），跟 Zhou 等［10］的报道相似，这提示肾小球TGF-β1表达异常增高是导致阿霉素肾小球硬化大鼠肾小球病理损害的机制之一，普罗布考治疗组大鼠TGF-β1的表达明显低于模型组（P<0.05），这与文献报道［11］相似。

本实验观察到普罗布考可降低阿霉素肾硬化大鼠肾小球TGF-β1的表达，减少尿蛋白排泄量，改善肾功能，减轻肾组织病理损伤，这提示普罗布考对大鼠肾小球硬化的防治作用可能与其抑制TGF-β1的表达有关，但该药延缓肾小球硬化的其他机制仍待进一步探讨。

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