特发性血小板减少性紫瘢患者外周血淋巴细胞亚群和调节性T细胞的变化及临床意义

佟海侠，马良艳，陆春伟，王秋实

（1.中国医科大学附属盛京医院输血科，沈阳110022；2.中国医科大学公共卫生学院卫生检验教研室，沈阳110001）

特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一种常见的出血性自身免疫病，但发病机制尚未完全明了，难以找到真正特异而有效的治疗方法。近年来，越来越多的研究表明，ITP患者除有体液免疫异常外，都存在细胞免疫异常，发病与淋巴细胞亚群、细胞因子表达及功能改变有密切联系［1］。同时研究发现调节性T细胞（T regulatory cell，Treg细胞）是维持机体免疫耐受的重要调控者，在自身免疫病中的作用逐渐成为研究的热点。为了观察淋巴细胞免疫功能在ITP发病机制中的可能作用及Treg细胞与ITP发生、发展的关系及其临床意义，我们使用流式细胞分析仪检测40例初诊急性ITP患者外周血淋巴细胞亚群的水平和Treg细胞的数量，并与40例健康者进行比较，以观察其在ITP发病中的变化和临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象及分组：全部为中国医科大学盛京医院血液科门诊及住院初诊（治疗前）急性ITP患者，诊断根据临床血象和骨髓检查确诊，符合张之南《血液病诊断及疗效标准》［2］，ITP组40例，男18例，女22例，年龄3～43岁，中位年龄18岁；健康对照组40例，男24例，女16例，年龄19～54岁，中位年龄35岁。

1.1.2 主要试剂和仪器：MultiSET四色免洗淋巴细胞亚群试剂盒、FACS Lysing Solution红细胞裂解液、人调节性 T细胞检测试剂盒（CD25-APC、CD4-FITC、Foxp3-PE）购自美国 BD 公司；FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 淋巴细胞亚群检测方法：采集外周静脉血2.0 mL，EDTA-K2抗凝后备用。取2支FACS专用试管，各加入50 μL充分混匀的抗凝全血，分别加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 抗体和20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19标记的抗体。涡旋混匀，室温避光放置15～20 min。取出加入 450 μL1×FACS 溶血素，充分混匀，避光放置15 min。24 h内上机，用MultiSET软件获取15000个细胞进行检测。

1.2.2 CD4+CD25+调节性T细胞检测方法：严格按照调节性T细胞检测试剂盒说明书进行操作。流式细胞仪检测分析应用CellQuest软件，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，再以CD4和SSC设门选择CD4阳性细胞分析，分析CD25和Foxp3表达，检测结果分别以CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的百分率表示。以CD4+T细胞中表达CD25+荧光强度>CD4-T细胞中CD25+荧光强度者定义为CD4+CD25highT细胞。收集细胞数50000个/管。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 淋巴细胞亚群检测结果

ITP组CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+的比值均显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；CD8+T淋巴细胞百分比略升高，差异有统计学意义（P>0.05），CD19+B淋巴细胞百分比则显著高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；CD16+/56+NK细胞百分比显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

2.2 ITP患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达

实验结果（表2）表明ITP患者外周血中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；同时检测高表达CD25的CD4+T细胞（CD4+CD25high）和CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量变化。结果显示ITP患者中CD4+CD25highT细胞比例略高于正常对照组，差异无统计学意义（P>0.05），而ITP患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例低于对照组（P<0.05），差异有统计学意义。

3 讨论

T淋巴细胞在免疫反应中起重要作用，是细胞免疫的重要环节，按免疫应答中的功能不同，可将T细胞分成辅助性T细胞（helper T cell，Th）和抑制性T 细胞（T suppressor cell，Ts）。CD4+T 细胞是 T 辅助/诱导细胞的表面标志，具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能。CD8+是抑制性T细胞/细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，Tc）的表面标志，能抑制 T 细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞免抑和体液免抑的作用。细胞免疫与体液免疫相互促进，同时相互制约，T细胞比例失调必然导致B细胞的改变。CD19是与B细胞分化、活化、增殖及抗体产生的重要膜抗原，是鉴定B细胞的标志之一。CD16+56+是自然杀伤（natural killer，NK）细胞的特异性标志，NK 细胞对B细胞分化有抑制作用，能调节吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。

研究表明，Th/Ts细胞的平衡在自身免疫性疾病的发生、发展过程中起重要作用［3］。Th细胞是机体免疫应答的中心细胞，CD4+/CD8+细胞比值变化反应机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。淋巴细胞亚群检测结果显示ITP患者外周血NK细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD4+/CD8+比值均显著低于对照组，CD8+T细胞、CD19+B淋巴细胞高于对照组；以上结果与国内其他文献报道相同［4，5］。T细胞功能异常导致B淋巴细胞激活，产生针对血小板的自身抗体可能是ITP的发病机制之一［6］。ITP患者CD19+B淋巴细胞的明显升高提示B细胞活化可能是ITP抗血小板抗体产生的直接根源；另外ITP时NK细胞数量减少及活性降低，导致其对B细胞激活、增殖、分化和抗体应答的抑制能力下降，从而使B细胞异常活化，产生大量自身抗体，进而导致血小板的破坏增多。Johansson等［7］研究发现，激活的NK细胞能够抑制ITP的自身免疫反应。

1995年Sakaguchi等［8］首次发现Treg细胞是一种专职抑制细胞，具有独特免疫调节作用，并在动物实验中将其去除后引发了多种自身免疫性疾病，而回输后则可抑制上述疾病的发生。叉头/翼状螺旋转录因子（Fork-head/winged helix transcription factor，Foxp3）特异性地表达于Treg细胞，调节其发育、维持其功能，故被作为Treg细胞的特征性标记［9］。人类体内天然产生的Tregs来源于胸腺，占人外周血CD4+T细胞总数的5%～10%［10］。Treg细胞具有免疫无反应性和免疫抑制性两大功能特征。免疫无能性主要表现在对IL-2特异性抗原及抗原提呈细胞（APC）的刺激呈低反应状态，免疫抑制性则表现在TCR介导的信号刺激活化后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖。

我们观察40例ITP患者外周血CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比，结果显示较正常对照组明显增多；与罗祖军、孙雨梅等［11，12］报道的 ITP患者外周血CD4+CD25+T细胞百分率低于对照组有明显差异。考虑到ITP患者存在自身反应性T细胞的异常活化，而CD25也是细胞活化标志，活化的CD4+T效应细胞表面也表达CD25分子，很难区分这两群功能不相同的细胞，因此CD4+CD25+T细胞数量并不能代表真正的调节T细胞水平；如果实验中直接按照外周血CD4+CD25+T细胞数量进行比较，由于混杂有一些活化T细胞在内，会对实验结果的分析有影响。Clare等［13］发现人类外周血中高表达CD25的CD4+T细胞（CD4+CD25highT细胞）具有动物实验中所观察到的调节性T细胞所具有的低反应性及免疫抑制性的特性，而低表达CD25的CD4+T细胞却不具备上述特性，故认为CD4+CD25highT细胞就是存在于人体内的调节性T细胞。然而本研究观察到ITP患者外周血CD4+CD25highT细胞的比例并没有减少，但CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例却明显低于对照组。转录因子Foxp3可能是CD4+CD25+T细胞中主要的调节基因，是目前公认的CD4+CD25+Treg细胞的特异性标志，其他的淋巴细胞如CD4+CD25-T细胞、B细胞和CD8+T细胞仅表达少量的Foxp3。本研究在检测Treg细胞时，以CD4+CD25+Foxp3+来识别Treg细胞，更准确地反映了ITP患者Treg细胞数量的变化。

Treg细胞数量减少使机体内免疫耐受平衡破坏，不能正常抑制T细胞的活化，使患者体内存在大量活化的T淋巴细胞参与血小板的损伤。Liu等［14］发现活动期和非缓解期ITP患者Treg细胞百分比明显低于病情缓解期和健康人群。Sakakura等［15］研究认为抗血小板糖蛋白抗体阳性和病情严重的ITP患者Treg细胞数明显降低，病情缓解后Treg细胞数上升，同时外周血单个核细胞的Foxp3-mRNA水平明显增高。近来研究证实，Treg细胞通过抑制自身反应性T细胞的免疫反应，抑制T细胞的活化及促进某些抑制性细胞因子的分泌等，在自身免免疫性疾病的发生中发挥重要作用［16］。以上结果均提示ITP患者外周血Treg细胞比例降低，由此导致细胞免疫抑制功能缺陷，自身反应性T细胞活化，辅助B细胞产生自身抗体。由于ITP患者发病时体内Treg细胞水平降低，这提示我们可以以此为治疗靶点，采取一些能够提高Treg细胞水平及增强其功能的免疫疗法，以扭转患者体内的免疫紊乱，促进机体恢复。

本研究初步证实ITP发病机制中存在淋巴细胞免疫异常和免疫功能紊乱，淋巴细胞亚群水平和Treg细胞检测的联合使用对ITP的诊断及疗效观察有较好的实用价值。通过促进CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的增生分化，增强其免疫抑制功能，为有效运用免疫调节手段治疗难治性ITP开辟了一条新途径。

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