超声波辅助提取甘草总黄酮及其抗氧化性

2011-12-01 07:26邹玉红寇小燕韩秋霞
食品研究与开发 2011年9期
关键词:超氧抗氧化性吸光

邹玉红,寇小燕,韩秋霞

(山东科技大学,山东 青岛 266510)

黄酮类化合物具有显著的清除人体内自由基、治疗心血管疾病、抗心律失常、抗肿瘤,抗癌等药理保健功能[1-2]。国内外的研究表明,黄酮类化合物不仅具有多种生物学活性,而且具有剂量小、见效快、毒性低等优点,所以在食品和医药保健领域的开发利用方面有着十分广阔的前景。本试验探讨乙醇浓度、料液比、超声功率、超声时间4个因素对甘草总黄酮提取率的影响,以获取提取甘草总黄酮的最佳工艺参数,并研究其抗氧化性,为甘草的开发利用提供依据。

1 材料和仪器

1.1 材料与试剂

甘草茎切片:购于同仁堂大药房;芦丁标准品:国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、浓盐酸、邻苯三酚、硫酸亚铁、H2O2、水杨酸,均为分析纯。

1.2 仪器设备

超声波细胞破碎仪(JY98-Ⅲ型):宁波科生仪器厂;可见分光光度计(UNICO7200):上海精密科学仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱(101AB-1型):龙口市电炉制造厂;电子天平(YP202N):上海精密科学仪器有限公司;离心机(DL-5-B):常州市科源电子电器厂。

2 方法

2.1 原料的预处理

将甘草于65℃下干燥24 h,磨粉机粉碎,过100目的筛,收集备用。

2.2 提取方法

取1 g的甘草粉末按照单因素试验的条件用一定量的乙醇溶解20 min后,用超声波法提取。提取物经过离心后取上清,用乙醇补全体积。采用硝酸铝比色法,测定提取物中的黄酮含量。

2.3 甘草总黄酮的含量测定

2.3.1 标准曲线绘制

精密称取芦丁标准品19.5 mg,加入80%乙醇适量配成浓度为0.975 mg/mL的芦丁标准溶液,精密量取标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于20 mL刻度试管中,各加入5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL,6 min后加入10%的硝酸铝溶液0.5 mL,放置6 min,加入5%NaOH溶液5 mL,混合均匀,15 min后用水定容至10 mL,用紫外-可见分光光度计在510 nm处测吸光值,绘制标准曲线。

2.3.2 总黄酮含量测定[2]

取0.6 mL提取液,测定其510 nm处的吸光度值,根据标准曲线算出比色液中总黄酮的含量,按下式计算甘草粉中甘草总黄酮的含量。

式中:y为提取液比色液的吸光值;V为提取液总体积,mL;v为移取提取液的体积,mL(本实验过程中提取液显色时未特别注明时取0.6 mL);m为所称甘草粉的质量,g。

2.4 正交试验[3]

经过单因素初步预实验后,以乙醇浓度、超声频率、超声时间,料液比4个因素,取3个水平,设计L9(34)正交试验,以总黄酮提取率为考察指标,确定最佳提取工艺,因素水平如表1。

2.5 甘草总黄酮体外抗氧化性活性的研究

2.5.1 总黄酮对羟自由基(·OH)的清除作用

采用水杨酸法测定甘草黄酮对羟自由基的清除作用。在水杨酸体系中,水杨酸主要是起到显色作用,可测得溶液中剩余自由基的含量,以此判断抗氧化性。FeSO4和H2O2反应产生羟自由基,羟自由基氧化水杨酸产生2,3-二羟基苯甲酸,由2,3-二羟基苯甲酸在510 nm处的吸光值确定羟自由基的多少,吸光值越大,表明羟自由基越多。在反应体系中加入具有清除作用的物质降低该吸光值,通过测定吸光值确定加入的物质清除羟自由基效果。

表1 因素水平表Table 1 Factor level list

配制5份不同浓度的甘草黄酮溶液,取出2 mL于试管中,依次加入6 mmol/l FeSO4溶液2 mL,6 mmol/L H2O22 mL,摇匀后静置10 min。加入6 mmol/L水杨酸2 mL,摇匀后静置30 min,测定510 nm下吸光度,记为Di。用水代替水杨酸测定某浓度黄酮溶液的本底光密度Dj。用水代替抗氧化剂时测定的空白对照光密度D。

2.5.2 总黄酮对超氧自由基(O2-·)的清除作用[4]

采用邻苯三酚自氧化法,取50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5mL,加入4.2mL去离子水,混匀后25℃水浴保温20 min。再25℃水后立即倒入比色皿中,于325 nm处每隔30 s测A值1次,共5 min。计算对照溶液吸光度随时间的变化率Fr。再依上法试验,在加入邻苯三酚前加入1.0 mL甘草黄酮溶液,再加入3.2 mL去离子水,混匀25℃水浴保温20 min,取出后立即加入再25℃预热过的3 mmol/L的邻苯三酚0.3 mL,混匀,于325 nm处每隔30 s测A值1次,共5 min。计算黄酮溶液吸光度随时间的变化率Fx。

清除率S=(Fr-Fx)/Fr×100%

3 结果

3.1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁标准溶液质量浓度(c,mg/mL)与吸光度(A)进行线性拟合,得线性回归方程为y=10.404x-0.0209,R2=0.9943。式中:x为总黄酮(芦丁)含量;y为吸光值A。

3.2 总黄酮最佳提取条件的确定

正交试验结果和方差分析见表2。

结果显示四因素对甘草总黄酮提取的影响主次顺序为乙醇浓度、料液比、超声频率、超声时间。最佳提取条件为A2B3D2C3,即:乙醇浓度为75%、料液比为1∶25、超声频率为350 W,超声时间为25 min。在此条件下总黄酮得率为1.943%。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiments

3.3 甘草总黄酮的抗氧化活性研究

3.3.1 甘草总黄酮对羟自由基(·OH)的清除作用的结果

甘草总黄酮对羟自由基(·OH)的清除作用,结果见图1。

图1 甘草总黄酮对羟自由基(·OH)的清除Fig.1 The effect of flavonoids to clear hydroxyl radical(·OH)

由图1可知,甘草总黄酮对羟自由基具有清除作用。在一定浓度范围内,甘草总黄酮对羟自由基的清除能力随浓度的增加而增大。当溶液浓度达到1.1296 mg/mL时,对羟自由基(·OH)的清除率达到了55.73%。

3.3.2 甘草总黄酮对超氧自由基(O2-·)的作用的结果

甘草总黄酮对超氧自由基(O2-·)的清除作用,结果见图2。

图2 甘草总黄酮对超氧自由基(O2-·)的清除Fig.2 The effect of flavonoids to clear superoixide radical(O2-·)

由图2可知,甘草总黄酮对邻苯三酚自氧化产生的O2-·有抑制作用,其清除率随浓度的增大而增大,表明其抑制能力与浓度呈明显的量效关系。当溶液浓度达到1.1296 mg/mL时,甘草总黄酮对超氧自由基(O2-·)的清除率达到50%。

4 结论

本实验采用正交试验方法,确定了甘草总黄酮的最佳提取工艺:乙醇浓度为75%、料液比为1∶25、超声频率为350 W,超声时间为25 min。最终总黄酮得率为1.943%。同时通过对自由基的清除作用研究,证实了甘草总黄酮是一种有效的自由基清除剂。甘草总黄酮对羟自由基和超氧自由基有显著的清除作用,且清除作用随浓度和时间的增大而增强,由此可知甘草总黄酮是一种天然有效的自由基清除剂,具有一定的抗氧化性。本研究提取的甘草总黄酮可以广泛应用于食品和药品行业中,具有广阔的开发前景,为实现甘草深加工提供了一种新的途径。

[1]曾超珍,刘志祥,吴耀辉,等.超声波提取甘草黄酮及其抑菌活性研究[J].时珍国医国药,2007,18(10):2402-2403

[2]孙芸,阿依努尔·吾买尔,燕雪花,等.甘草黄酮的提取方法及药理作用研究进展[J].新疆中医药,2009,27(7):72-75

[3]严赞开.紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法[J].食品研究与开发,2007,28(9):164-165

[4]逯家辉,姜鑫,李昊龙,等.应用响应面法优化超声波法提取甘草中总黄酮的工艺[J].吉林大学学报:工学版,2008,38(2):292-298

[5]王桃云,陈鹏,董五科,等.超声波提取豆荚总黄酮优化工艺与抗氧化性研究[J].中国粮油学报,2009,24(6):114-117

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