超声波辅助提取甘草总黄酮及其抗氧化性

邹玉红，寇小燕，韩秋霞

（山东科技大学，山东 青岛 266510）

黄酮类化合物具有显著的清除人体内自由基、治疗心血管疾病、抗心律失常、抗肿瘤，抗癌等药理保健功能[1-2]。国内外的研究表明，黄酮类化合物不仅具有多种生物学活性，而且具有剂量小、见效快、毒性低等优点，所以在食品和医药保健领域的开发利用方面有着十分广阔的前景。本试验探讨乙醇浓度、料液比、超声功率、超声时间4个因素对甘草总黄酮提取率的影响，以获取提取甘草总黄酮的最佳工艺参数，并研究其抗氧化性，为甘草的开发利用提供依据。

1 材料和仪器

1.1 材料与试剂

甘草茎切片：购于同仁堂大药房；芦丁标准品：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、浓盐酸、邻苯三酚、硫酸亚铁、H2O2、水杨酸，均为分析纯。

1.2 仪器设备

超声波细胞破碎仪（JY98-Ⅲ型）：宁波科生仪器厂；可见分光光度计（UNICO7200）：上海精密科学仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱（101AB-1型）：龙口市电炉制造厂；电子天平（YP202N）：上海精密科学仪器有限公司；离心机（DL-5-B）：常州市科源电子电器厂。

2 方法

2.1 原料的预处理

将甘草于65℃下干燥24 h，磨粉机粉碎，过100目的筛，收集备用。

2.2 提取方法

取1 g的甘草粉末按照单因素试验的条件用一定量的乙醇溶解20 min后，用超声波法提取。提取物经过离心后取上清，用乙醇补全体积。采用硝酸铝比色法，测定提取物中的黄酮含量。

2.3 甘草总黄酮的含量测定

2.3.1 标准曲线绘制

精密称取芦丁标准品19.5 mg，加入80%乙醇适量配成浓度为0.975 mg/mL的芦丁标准溶液，精密量取标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于20 mL刻度试管中，各加入5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL，6 min后加入10%的硝酸铝溶液0.5 mL，放置6 min，加入5%NaOH溶液5 mL，混合均匀，15 min后用水定容至10 mL，用紫外-可见分光光度计在510 nm处测吸光值，绘制标准曲线。

2.3.2 总黄酮含量测定[2]

取0.6 mL提取液，测定其510 nm处的吸光度值，根据标准曲线算出比色液中总黄酮的含量，按下式计算甘草粉中甘草总黄酮的含量。

式中：y为提取液比色液的吸光值；V为提取液总体积，mL；v为移取提取液的体积，mL（本实验过程中提取液显色时未特别注明时取0.6 mL）；m为所称甘草粉的质量，g。

2.4 正交试验[3]

经过单因素初步预实验后，以乙醇浓度、超声频率、超声时间，料液比4个因素，取3个水平，设计L9（34）正交试验，以总黄酮提取率为考察指标，确定最佳提取工艺，因素水平如表1。

2.5 甘草总黄酮体外抗氧化性活性的研究

2.5.1 总黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用

采用水杨酸法测定甘草黄酮对羟自由基的清除作用。在水杨酸体系中，水杨酸主要是起到显色作用，可测得溶液中剩余自由基的含量，以此判断抗氧化性。FeSO4和H2O2反应产生羟自由基，羟自由基氧化水杨酸产生2，3-二羟基苯甲酸，由2，3-二羟基苯甲酸在510 nm处的吸光值确定羟自由基的多少，吸光值越大，表明羟自由基越多。在反应体系中加入具有清除作用的物质降低该吸光值，通过测定吸光值确定加入的物质清除羟自由基效果。

表1 因素水平表Table 1 Factor level list

配制5份不同浓度的甘草黄酮溶液，取出2 mL于试管中，依次加入6 mmol/l FeSO4溶液2 mL，6 mmol/L H2O22 mL，摇匀后静置10 min。加入6 mmol/L水杨酸2 mL，摇匀后静置30 min，测定510 nm下吸光度，记为Di。用水代替水杨酸测定某浓度黄酮溶液的本底光密度Dj。用水代替抗氧化剂时测定的空白对照光密度D。

2.5.2 总黄酮对超氧自由基（O2-·）的清除作用[4]

采用邻苯三酚自氧化法，取50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH8.2）4.5mL，加入4.2mL去离子水，混匀后25℃水浴保温20 min。再25℃水后立即倒入比色皿中，于325 nm处每隔30 s测A值1次，共5 min。计算对照溶液吸光度随时间的变化率Fr。再依上法试验，在加入邻苯三酚前加入1.0 mL甘草黄酮溶液，再加入3.2 mL去离子水，混匀25℃水浴保温20 min，取出后立即加入再25℃预热过的3 mmol/L的邻苯三酚0.3 mL，混匀，于325 nm处每隔30 s测A值1次，共5 min。计算黄酮溶液吸光度随时间的变化率Fx。

清除率S=（Fr-Fx）/Fr×100%

3 结果

3.1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁标准溶液质量浓度(c，mg/mL)与吸光度（A）进行线性拟合，得线性回归方程为y=10.404x-0.0209，R2=0.9943。式中：x为总黄酮（芦丁）含量；y为吸光值A。

3.2 总黄酮最佳提取条件的确定

正交试验结果和方差分析见表2。

结果显示四因素对甘草总黄酮提取的影响主次顺序为乙醇浓度、料液比、超声频率、超声时间。最佳提取条件为A2B3D2C3，即：乙醇浓度为75%、料液比为1∶25、超声频率为350 W，超声时间为25 min。在此条件下总黄酮得率为1.943%。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiments

3.3 甘草总黄酮的抗氧化活性研究

3.3.1 甘草总黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用的结果

甘草总黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用，结果见图1。

图1 甘草总黄酮对羟自由基（·OH）的清除Fig.1 The effect of flavonoids to clear hydroxyl radical（·OH）

由图1可知，甘草总黄酮对羟自由基具有清除作用。在一定浓度范围内，甘草总黄酮对羟自由基的清除能力随浓度的增加而增大。当溶液浓度达到1.1296 mg/mL时，对羟自由基（·OH）的清除率达到了55.73%。

3.3.2 甘草总黄酮对超氧自由基（O2-·）的作用的结果

甘草总黄酮对超氧自由基（O2-·）的清除作用，结果见图2。

图2 甘草总黄酮对超氧自由基（O2-·）的清除Fig.2 The effect of flavonoids to clear superoixide radical（O2-·）

由图2可知，甘草总黄酮对邻苯三酚自氧化产生的O2-·有抑制作用，其清除率随浓度的增大而增大，表明其抑制能力与浓度呈明显的量效关系。当溶液浓度达到1.1296 mg/mL时，甘草总黄酮对超氧自由基（O2-·）的清除率达到50%。

4 结论

本实验采用正交试验方法，确定了甘草总黄酮的最佳提取工艺：乙醇浓度为75%、料液比为1∶25、超声频率为350 W，超声时间为25 min。最终总黄酮得率为1.943%。同时通过对自由基的清除作用研究，证实了甘草总黄酮是一种有效的自由基清除剂。甘草总黄酮对羟自由基和超氧自由基有显著的清除作用，且清除作用随浓度和时间的增大而增强，由此可知甘草总黄酮是一种天然有效的自由基清除剂，具有一定的抗氧化性。本研究提取的甘草总黄酮可以广泛应用于食品和药品行业中，具有广阔的开发前景，为实现甘草深加工提供了一种新的途径。

[1]曾超珍,刘志祥,吴耀辉，等.超声波提取甘草黄酮及其抑菌活性研究[J].时珍国医国药,2007,18(10):2402-2403

[2]孙芸，阿依努尔·吾买尔，燕雪花，等.甘草黄酮的提取方法及药理作用研究进展[J].新疆中医药，2009,27(7):72-75

[3]严赞开.紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法[J].食品研究与开发,2007,28(9):164-165

[4]逯家辉,姜鑫,李昊龙，等.应用响应面法优化超声波法提取甘草中总黄酮的工艺[J].吉林大学学报：工学版,2008,38(2):292-298

[5]王桃云，陈鹏，董五科，等.超声波提取豆荚总黄酮优化工艺与抗氧化性研究[J].中国粮油学报，2009,24(6):114-117